埃及伊蚊（Aedes aegypti）成体细菌微生物群对专性微孢子虫寄生虫Edhazardia aedis感染具有显著稳健性

《Environmental Microbiology》：The Adult Aedes aegypti Bacterial Microbiota is Robust to Infection with the Obligate Microsporidian Parasite Edhazardia aedis

　　

Edhazardia aedis是一种专性胞内微孢子虫寄生虫，寄生于节肢动物媒介埃及伊蚊（Aedes aegypti），后者是多种具有全球健康重要性的脊椎动物病原体的传播媒介。E. aedis对A. aegypti具有高度致病性，感染对其多项生活史性状产生严重不利影响，包括寿命、体型、宿主寻求与吸血倾向以及繁殖能力。本研究利用16S rRNA基因的高通量扩增子测序，探究了E. aedis感染对成年雌性A. aegypti细菌微生物群的影响。测序数据分析显示，细菌微生物群落对E. aedis感染具有显著稳健性，研究人员未观察到感染对α多样性或β多样性、任何分类群的差异丰度、预测代谢功能谱或细菌载量产生显著影响。数据表明，尽管E. aedis对成年雌性蚊虫的健康与适合度产生显著影响，但并未影响其微生物群。这些结果为宿主、病原体与微生物群之间的三方关系（或缺乏这种关系）提供了独特见解。

论文解读文章

研究背景与科学问题

微生物群与宿主共同构成“全生物”（holobiont）概念下的复杂“元生物体”，在宿主免疫、代谢等关键生理过程中发挥重要作用。蚊虫微生物群研究近年来受到广泛关注，因为微生物可被利用来抑制蚊媒疾病（如登革热、寨卡、基孔肯雅热和黄热病）的传播。例如，内共生菌沃尔巴克氏体（Wolbachia）和昆虫病原菌以色列苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis israelensis）已被用于抑制媒介种群并取得一定成效。然而，蚊媒疾病仍是日益严重的全球公共卫生问题，2024年成为有史以来登革热病例最严重的一年，对新解决方案的需求依然迫切。

在蚊虫-微生物-病原体三方互作研究中，已有大量证据表明多种病原体感染可改变节肢动物宿主的微生物群，包括细菌、病毒和微孢子虫等。然而，关于专性微孢子虫寄生虫Edhazardia aedis感染对埃及伊蚊（Aedes aegypti）细菌微生物群的影响此前尚未被探索。E. aedis是一种真菌样专性胞内寄生虫，可经水平途径感染A. aegypti幼虫，并在成虫期主要局限于脂肪体卵母细胞（oenocytes），直至雌蚊吸血后感染卵巢并实现经卵垂直传播。感染E. aedis会显著降低蚊虫寿命、体型、宿主寻求倾向、吸血倾向和繁殖能力，并改变与免疫和代谢相关基因的全转录组表达。此前研究表明，多种微孢子虫感染可改变蜜蜂、家蚕、南美白对虾等节肢动物宿主的微生物群，但E. aedis对A. aegypti微生物群的影响尚属空白。

研究目的与结论

本研究旨在探究水平感染E. aedis对未吸血成年雌性A. aegypti腹部细菌微生物群的丰度、多样性及预测代谢功能的影响。研究人员采用三对配对的E. aedis处理组与模拟感染对照组幼虫平行饲养方案，在成虫羽化后3–5天采集每笼7–8只雌蚊个体腹部，提取DNA后利用16S rRNA基因V3-V4高变区进行定量PCR和高通量扩增子测序。结果显示，E. aedis感染对细菌微生物群的α多样性（Chao1、Shannon、Simpson指数）、β多样性（基于Bray-Curtis距离、稳健中心对数比（rclr）变换、零值插补中心对数比（clr）变换及系统发育等距对数比（PhILR）变换的排序分析）、差异丰度（ANCOM-BC2、ALDeX2、LinDA三种方法）、预测代谢功能谱（FAPROTAX和Tax4Fun2）以及细菌载量（16S qPCR）均无显著影响。这一发现表明，尽管E. aedis对蚊虫健康与适合度造成严重损害，但其细菌微生物群具有显著稳健性。该研究为理解蚊虫全生物中宿主、病原体与微生物群之间可能缺乏互作提供了独特见解。

主要技术方法

研究人员从垂直感染的A. aegypti幼虫中分离纯化E. aedis孢子，通过Ludox密度梯度离心获得纯化孢子溶液，用于水平感染实验。实验采用三对配对mesocosm（中宇宙）复制结构，将同一卵纸孵化的幼虫分为三组，每组再随机分为E. aedis感染组和模拟感染对照组。幼虫孵化后，各饲养盘均接种来自巴尔的摩（Baltimore, MD）2016年9月采集并储存的Aedes幼虫孳生地的轮胎水（tire water）以模拟自然环境微生物群落。感染组幼虫暴露于约75,000个纯化孢子，对照组接受相同处理但不含孢子。成虫羽化后3–5天采集雌蚊腹部，使用ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit提取总DNA。16S rRNA基因V3-V4区域扩增后经Illumina NextSeq 2000平台进行300 bp双端测序。生物信息学分析采用Cutadapt去除引物和接头污染，DADA2进行过滤、去重、样本推断、嵌合体识别和双端合并，IDTAXA基于SILVA SSU r138训练集进行分类学注释，decontam包基于频率方法识别并去除污染物。细菌载量通过16S rRNA基因定量PCR（qPCR）估算，以蚊虫RpS7基因作为参考基因，采用X₀方法计算标准化值。

研究结果

2.1 测序数据集特征

最终测序数据集包含5,757,955条总读数，平均每样本122,510条读数，共3,667个扩增子序列变异体（ASV），平均每样本221个ASV。稀释曲线表明测序深度充分。20个“核心ASV”（占所有ASV的0.01%）存在于全部47个样本中。

2.2 分类学组成

腹部细菌微生物群主要由变形菌门（Pseudomonadata）和厚壁菌门（Bacillota）主导，放线菌门（Actinomycetota）也占相当比例。在Pseudomonadata中，γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）丰度高于α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）；Bacillota中以芽孢杆菌纲（Bacilli）为主；Actinomycetota中以放线菌纲（Actinobacteria）为主。轮胎水接种物中共检测到286个ASV，其中132个ASV也在蚊虫样本中检出，163个ASV仅存在于轮胎水中。共享ASV占轮胎水读数的约50.0%（90,950/182,007）和蚊虫样本读数的57.1%（3,288,839/5,757,955），并构成20个核心ASV中的16个。

2.3 E. aedis感染不改变未吸血雌性A. aegypti腹部细菌微生物群的丰度、分类多样性及预测代谢功能谱

α多样性分析采用Chao1、Shannon和Simpson指数，Wilcoxon秩和检验显示E. aedis感染状态对任何α多样性指标均无显著影响（p_Chao1=0.246，p_Shannon=0.907，p_Simpson=0.742）；Kruskal-Wallis检验显示幼虫中宇宙复制对α多样性也无显著影响。β多样性分析采用Bray-Curtis距离、稳健CLR变换、零值插补CLR变换和PhILR变换四种方法构建排序，PERMANOVA检验（限制置换以考虑幼虫中宇宙复制效应）显示感染对β多样性均无显著影响（p值分别为0.368、0.698、0.245、0.428）。细菌载量分析中，混合效应线性回归显示E. aedis感染对log₁₀转换的ΔX_0,16S值无显著影响（p=0.819）。三种差异丰度分析方法（ANCOM-BC2、ALDeX2、LinDA）均未可靠鉴定出感染组与对照组之间持续差异丰度的分类群。FAPROTAX和Tax4Fun2功能预测分析均未发现感染对细菌微生物群代谢功能谱的影响。

讨论与结论

讨论部分指出，与多种其他蚊虫病原体（如虫媒病毒、疟原虫、昆虫病原真菌）感染可扰动宿主微生物群不同，E. aedis感染未改变A. aegypti腹部细菌微生物群。这一差异可能归因于E. aedis在成虫期不侵入肠道细胞，因此不直接与肠道组织或肠道相关微生物群接触，而上述其他病原体均在某一阶段与肠道腔相互作用。尽管E. aedis感染会引发成虫显著的转录组免疫应答，但该应答的组织特异性（是否发生在肠道）尚未明确。此前研究显示，E. aedis阳性雌蚊经口暴露于粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）后，该菌载量高于E. aedis阴性蚊虫，但S. marcescens在本研究微生物群中未被检出，提示E. aedis对宿主与肠道微生物关系的调节具有情境依赖性。与Trzebny等人（2023）在波兰野外蚊虫中的研究一致，该研究也未发现微孢子虫感染对细菌α或β多样性的影响，但观察到微孢子虫感染与部分蚊种中螺原体科（Spiroplasmataceae）和明串珠菌科（Leuconostocaceae）细菌的存在呈正相关，并伴随特定预测代谢功能通路比例增加。研究人员推测，蚊虫感染性微孢子虫可能具有某种未知生物学特征，使其不引起宿主微生物群的剧烈扰动；也可能只有部分微生物群成员能在特定微孢子虫感染期间机会性增殖，而本研究中蚊虫微生物群恰好缺乏这些成员。此外，本研究使用未吸血雌蚊，而野外蚊虫可能经历多次吸血，吸血与A. aegypti繁殖和免疫密切相关并会短暂重塑肠道微生物群多样性，因此未来研究应关注吸血后（E. aedis已定殖卵巢）的感染效应。

结论部分翻译：数据表明，成年雌性A. aegypti细菌微生物群对水平感染E. aedis（一种对其宿主A. aegypti造成严重适合度缺陷的微孢子虫病原体）的反应是不改变的。有趣的是，该系统中感染对本地微生物群无影响的现象，与众多节肢动物-病原体系统中病原体感染改变微生物群的观察结果形成对比，包括微孢子虫病原体。然而，该发现与先前一项同样显示微孢子虫感染不影响蚊虫细菌群落结构的研究一致。需要进一步研究以揭示宿主调控微生物群的机制，以及这种调控是否与感染诱导的宿主生理变化（如免疫和代谢）相交织。总体而言，本研究推动了对E. aedis的持续研究，并为媒介蚊虫、病原体与微生物群之间的三方互作（或缺乏互作）提供了见解。