粘性采样器真菌生物气溶胶宏条形码分析的直接DNA提取工作流程

《Environmental Microbiology》：A Direct DNA Extraction Workflow for Metabarcoding Fungal Bioaerosols From Adhesive Samplers

　　

中文摘要翻译 监测真菌生物气溶胶对于理解其对人类健康和作物生产力的影响至关重要。然而，当前的监测方法依赖于培养依赖技术，这低估了真菌暴露的多样性。粘性涂层薄膜可以有效捕获空气中的颗粒物，但由于缺乏针对粘性捕获表面的标准化DNA提取方法，其被认为不适用于下游DNA分析。本研究提出并验证了一种优化的粘性薄膜DNA提取方案，该方案能够实现对收集在96孔板密封膜（“Sticky sampler”）上的真菌生物气溶胶进行直接、非培养依赖的ITS2宏条形码分析。这一经过验证的方法被应用于从四个农业农场和一个家庭花园采集的田间样品，以评估真菌生物气溶胶的季节性和空间变化。分析揭示了与地理和土地管理相关的显著位点特异性差异，以及花园真菌群落的明显季节性转变。该研究表明，结合优化后的DNA提取方法，粘性采样器为解决空气传播真菌的生态学意义的时空动态提供了一种实用且廉价的工具，为环境生物气溶胶的高可扩展性监测开辟了新机遇。

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研究背景

真菌生物气溶胶是空气中生物颗粒的主要组成部分，主要通过孢子释放传播。其组成和浓度受温度、湿度和风模式等环境因素影响，呈现出明显的空间和季节分布特征。暴露于真菌生物气溶胶与多种不良后果相关，包括农业中的作物减产以及人类的感染性疾病、呼吸道感染和皮肤过敏。有效的空气采样是可靠监测的基础，但现有方法面临挑战：培养依赖技术只能捕获一小部分真菌群落；而基于胶水的采样器虽能捕获广泛范围的颗粒、无需电力且成本低廉，适合大规模监测，却因缺乏从粘性表面高效提取DNA的标准化方案，其在分子生物气溶胶研究中的应用受到限制。

研究目的与意义

为了解决上述瓶颈，研究人员开发并验证了一种优化的DNA提取方案，使得从粘性薄膜（“Sticky sampler”）上收集的真菌生物气溶胶能够直接进行非培养依赖的ITS2宏条形码分析。通过将这一方法与高通量测序相结合，成功表征了空气真菌群落在不同农场间的空间差异以及在一个家庭花园中的季节动态。该研究证明了粘性采样器结合优化的DNA提取是一种实用且廉价的研究工具，能够解决空气传播真菌的生态学意义的时空动态，为大规模、社区参与式的环境生物气溶胶监测提供了新途径。

关键技术方法

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，使用商业化的Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film作为“Sticky Sampler”进行被动空气采样。其次，利用包含烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、紫红篮状菌（Talaromyces purpurogenus）和斯托尔篮状菌（Talaromyces stollii）三种真菌的人造微生物群落（mock community）对DNA提取方法进行优化。关键的优化在于比较了两种策略：一种是使用丙酮或乙醇去除胶层的溶剂法，另一种是跳过胶层去除步骤的直接提取法。最终采用优化的直接提取法，并使用DNeasy PowerSoil Pro DNA Extraction Kit进行DNA提取。真菌DNA的定量通过靶向18S rRNA的FungiQuant qPCR检测完成。用于宏条形码分析的ITS2区域则使用引物对ITS7F和ITS4R进行扩增，并在Illumina MiSeq平台上进行测序。样本来源包括英国四个农业农场的12个采样点以及一个伦敦家庭花园在三个季节的样本。

研究结果

3.1 直接提取验证

3.1.1 与溶剂法的比较：在所有测试条件下，溶剂法均未检测到扩增信号，因此该方法未被进一步采用。相反，直接DNA提取法在宽浓度范围内均能成功扩增，证明了其可行性。

3.1.2 采样与非采样的验证：通过比较将孢子接种到粘性采样器后再提取（采样组）和直接提取孢子（非采样组），发现两组在每样本10²孢子的浓度下均可稳定检测到扩增，确定了检测限。有趣的是，采样组的DNA拷贝数略高于非采样组，可能归因于粘性采样器增强了裂解过程中的珠接触效率。

3.1.3 DNA回收的位置一致性：对单个采样器上五个预设位置的DNA回收量进行分析，单因素方差分析和线性混合效应模型均表明位置效应不显著，说明分析采样器的任意一部分即可可靠代表整体真菌负荷。

3.2 采样器性能与适用性

3.2.1 粘性采样器的基线DNA产量：对未经UV处理的新粘性采样器进行qPCR检测，结果显示背景DNA可忽略不计，证明其无需灭菌即可用于生物气溶胶分析。

3.2.2 黑色碳带与粘性采样器的比较：在相同条件下，黑色碳带无论接种人造群落还是野外暴露后，均无法回收DNA，且在提取过程中其粘性层会脱落形成暗色聚集体干扰纯化。而粘性采样器在整个过程中保持物理完整和稳定。

3.2.3 所选粘性采样器与其他PCR薄膜的比较：小规模比较显示，本研究所用的Bio-Rad PCR密封膜在相同暴露和提取条件下产生的DNA拷贝数最高。

3.2.4 基于测序的背景污染评估：测序分析表明，实验样本与非UV处理的空白对照之间的扩增子序列变异体重叠极小，证实了环境数据集的可靠性。

3.3 时间序列实验

在室内外环境中，真菌DNA随时间累积。室外采样器的DNA拷贝数始终高于室内，且两者在4周内均未达到平台期。这表明4周的部署时间对于DNA分析是合适的，尤其是在室外环境。

3.4 现场验证

3.4.1 粘性采样器捕获农场间空间变异：基于Bray-Curtis距离的主坐标分析显示，四个农场的空气真菌群落呈现清晰聚类，经置换多元方差分析确认差异显著。各农场在属水平上的群落组成差异很大，例如A农场特有的高丰度Puccinia和Vishniacozyma，以及B农场优势的Alternaria*。

3.4.2 粘性采样器捕获花园的季节动态：花园样本显示明显的季节变化，春季样本在排序空间中与秋季和冬季样本形成独特聚类。香农指数在春季最低，与冬季有显著差异。属水平组成也随季节变化，如春季叶部病原菌Podosphaera和Sawadaea更丰富，而喜冷湿环境的Botrytis在秋冬更突出。

讨论与结论

讨论部分指出，溶剂法的失败可能源于溶剂与胶基质的不良相互作用导致DNA损失或抑制。直接提取法的成功表明无需溶解胶层即可高效回收DNA。粘性采样器材料的热稳定性和机械稳定性是其优于其他胶基采样器（如黑色碳带）的关键。时间序列实验表明粘性采样器可作为被动收集器，但未来需扩大采样点和增加重复以确定最短采样时长。现场应用的成功验证了该工作流程在实际环境中的适用性，揭示了农业因素（如作物类型、杀菌剂使用）比地理距离更能影响空气真菌群落，并捕捉到了由植物相关病原菌向腐生菌转变的生态学意义的季节演替。研究结论强调，结合优化的DNA提取和ITS2宏条形码分析，粘性采样器为大规模、低成本的真菌生物气溶胶监测提供了一个实用且可扩展的框架，为公共卫生、农业和公民科学领域的应用奠定了基础。