基于Klenow片段辅助的目标回收和限制性内切酶驱动的多足DNA行走器级联扩增技术的CRISPR/Cas13a适配体传感器在牛奶和蜂蜜中检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的方法

《Microchemical Journal》：Fluorometric determination of MRSA in milk and honey with a CRISPR/Cas13a aptasensor based on Klenow fragment–aided target recycling and nicking endonucleases–powered multipedal DNA walker cascade amplification

• 开发了一种基于超敏感CRISPR/Cas13a的适配体传感器，用于检测MRSA。
• 通过酶辅助反应和DNA步行器级联扩增提高了灵敏度。
• 在10分钟内达到了5 CFU/mL的低检测限。
• 成功地在牛奶和蜂蜜样品中检测到了MRSA。

引言
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种重要的多重耐药病原体，对临床抗菌治疗提出了严峻挑战，并对全球食品安全构成严重威胁[1][2]。在畜牧业中滥用抗生素导致牲畜来源的食品（包括肉类、乳制品和鸡蛋）反复受到MRSA的污染[3][4]。MRSA中的耐药性主要由mecA基因决定，该基因编码青霉素结合蛋白2a（PBP2a）。由于PBP2a在其他细菌菌株中的表达频率较低且分布有限，因此它成为识别MRSA的高度特异性的分子生物标志物[5]。利用PBP2a作为特异性识别元件，可以准确可靠地在复杂的食品基质中检测MRSA，同时最大限度地减少其他食源性微生物引起的假阳性结果。因此，通过PBP2a对MRSA进行精确识别和定量分析为食品安全监测、微生物污染的早期检测以及防止耐药细菌在食品链中的跨区域传播提供了坚实的基础。

目前，检测MRSA的传统方法主要包括培养依赖性测定[6]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[7]和聚合酶链反应（PCR）[8]。细菌培养被认为是诊断的金标准，因为它具有高可靠性和成本效益；然而，其检测时间较长（需24至72小时），并且检测灵敏度较低，不足以检测食品基质中的微量或受损MRSA。ELISA通过抗原和抗体之间的特异性相互作用实现高通量快速筛选；然而，其固有的低灵敏度和非特异性吸附倾向常常导致假阳性信号。针对mecA基因的PCR测定具有优异的灵敏度和特异性，可用于MRSA的检测。但是，这些方法的实际应用受到设备成本高、需要专业技术以及食品样品中存在显著基质干扰的限制，严重限制了其在现场检测中的应用。总体而言，这些传统方法未能充分满足当前对快速、灵敏和简便检测MRSA的需求。

近年来，已经开发出多种先进的传感策略来实现高效检测MRSA，包括电化学免疫条传感器[9]、基于CRISPR/Cas12a的生物传感器[10]、适配体介导的比色测定[11]和MoS2NF@AuNPs增强的电化学发光平台[12]。尽管这些新兴技术比传统方法具有更好的分析性能，但它们仍存在一些局限性，如接口修改繁琐、背景信号高和材料合成过程复杂。因此，迫切需要开发一种新型、稳定且实用的传感策略，以实现真实食品样品中MRSA的快速灵敏检测。

酶辅助的目标回收是一种非常有前途的等温扩增策略，用于超灵敏生物传感应用，可以在不依赖热循环装置的情况下重新利用目标分子并增强信号。这种酶法方法促进了循环杂交和链置换，使单个目标分子能够参与多次识别事件，显著提高分析灵敏度[13][14]。DNA聚合酶I的Klenow片段（KF）作为一种基本功能酶，具有显著的5′→3′聚合酶活性和强烈的链置换能力[15]。与传统核酸酶不同，KF促进模板导向的DNA合成和链置换，从而保持目标分子的完整性并使循环反应持续进行。KF介导的回收系统在温和的等温条件下稳定运行，背景干扰低且特异性高。这些系统已广泛应用于microRNA[16]、mecA基因[17]、 saxitoxin[18]和小胞外囊泡（sEVs）[19]等目标的灵敏检测。DNA步行器是由DNA组成的智能动态纳米机器，模仿天然马达蛋白的运动机制，将分子识别事件转化为自我导向的机械运动，从而成为生物传感应用中信号放大的适应性模块[20][21]。多足DNA步行器比传统的单足和双足步行器具有更好的结构稳定性、运动连续性和动力学性能，这归因于其多足配置，有效防止了脱离轨道[22][23]。nicking内切酶Nb.BbvCI因其能够选择性切割双链DNA中的一条链同时保持另一条链的完整性而被认为是高效组装分子步行器的理想催化成分[24][25]。这一特性促进了可逆和重复的杂交、酶切割以及随后片段的释放。利用Nb.BbvCI酶，多足DNA步行器能够在指定轨道上自主移动，产生显著的累积信号，从而实现强化的级联扩增。Nb.BbvCI驱动的多足步行器在临床诊断、食品安全评估和环境监测等应用中显示出巨大的潜在优势[26][27]。迄今为止，尚未报道结合KF辅助目标回收与Nb.BbvCI激活的多足DNA步行器技术来检测MRSA的双重扩增方法。因此，开发这种创新的协同传感平台对于满足快速、高度灵敏地检测病原细菌的需求至关重要。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关（Cas）系统作为原核生物的适应性免疫机制。利用其出色的可编程性和精确的序列识别能力，这种内在的微生物防御系统已被广泛应用于高级生物传感平台中，用于核酸检测[28][29]。第2类CRISPR系统以其单组分效应蛋白为特征，在当代生物传感研究中占主导地位，能够实现快速、特异性和高度灵敏的目标核苷酸序列检测。CRISPR/Cas13a是一种典型的VI型RNA依赖性核糖核酸酶，在生物传感平台的开发中表现出显著优势。在crRNA的指导下特异性识别并结合目标RNA后，Cas13a发生构象变化，既能够切割目标转录本，又能显著非特异性切割相邻的报告基因RNA分子。内在的附带切割活性提供了显著的信号放大能力，从而使基于Cas13a的生物传感器具有出色的分析性能，无需依赖仪器即可进行检测。因此，基于CRISPR/Cas13a的传感平台已广泛用于多种生物标志物的定量检测，如B型利钠肽[30]、环状RNA[31]、三磷酸腺苷（ATP）[32]和microRNAs[33]。目前对基于Cas13a的检测方法的研究主要集中在病毒病原体和小分子生物标志物上，对耐药细菌（尤其是MRSA）的检测关注较少。因此，迫切需要开发和改进基于CRISPR/Cas13a的传感方法，以实现复杂样品基质中MRSA的高效、精确和实用检测。

适配体是单链寡核苷酸，具有高结合亲和力和出色的目标特异性。这些特性已被广泛应用于生物传感分析、临床诊断和生物特异性识别等领域[34]。为了提高结构稳定性和分析性能，将三螺旋分子开关（THMS）整合到适配体设计中是一种复杂而有前景的传感器构建方法。三螺旋结构通过Hoogsteen氢键稳定，使构建的适配体能够在目标识别时发生可逆的构象变化。这种基于THMS的独特结构设计有效抑制了背景干扰，并显著提高了信号转导效率。适配体与其目标之间的特异性相互作用会引起显著的构象变化，进而促进三螺旋结构的解组装或重新组装。这一过程有效地将微妙的分子相互作用转化为可测量的输出信号。这些智能适配体分子开关具有显著的选择性、良好的灵敏度和令人满意的再生能力，已被广泛用于多种分析物的快速筛选和定量分析，如氯霉素[35]、黄曲霉毒素B1[36]、脂钙蛋白1[37]和阿莫西林[38]。它们的广泛应用表明在食品分析和环境监测领域具有巨大潜力。

氧化石墨烯（GO）是一种二维碳材料，由于其出色的物理和化学性质而被广泛用于生物测定[39][40]。GO具有较大的比表面积，可以通过物理吸附或化学偶联与核酸分子结合。此外，由于其广泛的吸收光谱和卓越的淬灭能力，GO在荧光共振能量转移（FRET）研究中表现出优异的性能。GO还可以保护表面固定的核酸免受环境中的酶降解。因此，我们开发了一种基于CRISPR/Cas13a的荧光适配体传感器，利用GO平台实现对牛奶和蜂蜜样品中MRSA的灵敏检测。该生物传感器结合了KF辅助的目标回收和Nb.BbvCI驱动的多足DNA步行器，实现双酶级联信号放大。GO的加入有效减少了背景干扰，而双重扩增机制共同增强了信号强度。构建的适配体对MRSA的检测限极低，为5 CFU/mL，表现出显著的特异性，能够区分目标细菌和非目标菌株。此外，在人工污染的牛奶和蜂蜜样品中的检测准确性与传统培养技术相当。因此，这种生物传感平台为MRSA的快速检测提供了一种可靠的方法，在食品安全监测、质量控制和服务早期风险评估方面具有巨大潜力。

材料与试剂
链霉亲和素磁珠（MBs）购自Thermo Fisher Scientific（上海，中国）。GO粉末和羧基化氧化石墨烯（CGO）分散液由Xianfeng Materials Technology（南京，中国）提供。所有寡核苷酸序列均由上海Sangon生物工程技术有限公司（上海，中国）化学合成和纯化。具体序列详见表S1。

本研究使用的关键试剂

适配体与PBP2a之间结合参数的研究
经过十四轮指数富集（SELEX）筛选的系统进化后，我们成功分离出一种特异性针对PBP2a转肽酶结构域的适配体。该适配体的解离常数（Kd）为30.21 ± 13.29 nM（图1A），表明该适配体能够以高亲和力结合PBP2a，具有高度灵敏和特异性的MRSA检测潜力。如图1B所示，

结论
总之，通过靶向PBP2a，成功构建了一种高灵敏度和特异性的荧光适配体传感器，用于快速检测MRSA。该方法结合了KF辅助的目标回收扩增、Nb.BbvCI驱动的多足DNA步行器级联扩增和CRISPR/Cas13a转切割信号放大，实现了多阶段循环信号放大，有效克服了传统方法信号输出低的局限性。

CRediT作者贡献声明
黄一涵：撰写-原始草稿、研究、正式分析、数据分析。
徐家鑫：软件开发、研究、正式分析。
何琪志：可视化、验证。
宁毅：撰写-审稿与编辑、监督、方法学、资金获取、概念构思。

利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢
本研究得到了国家自然科学基金[81803964, 82074250]、湖南省自然科学基金杰出青年项目[2023JJ10031]、湖南省自然科学基金[2025JJ60908]、星林人才培养计划、长沙市杰出创新青年项目[kq2209019]、湖南中医药大学学科建设“揭榜领航”项目[22JBZ031]、湖南中医药大学基础医学建设项目等的支持。