利用LwaCas13a核酸酶的附带切割活性构建CRISPR诊断平台，实现禽腺病毒4型和8b型的快速可视化检测

《Microchemical Journal》：Exploiting LwaCas13a nuclease collateral cleavage activity in a CRISPR diagnostic platform for rapid visual detection of fowl adenovirus serotype 4 and 8b

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  开发了一种用于FAdV-4和FAdV-8b的RPA-CRISPR-Cas13a等温检测平台。
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  荧光信号在10分钟内即可检测（5个反应循环），实现了对结果的快速判别。
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  基于荧光的检测方法对FAdV-4和FAdV-8b的检测限分别达到10⁰拷贝/μL和10¹拷贝/μL，对五种非目标禽类病毒均无交叉反应。
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  侧向流试纸条提供了无需仪器的可视化检测，对两种病毒均达到10¹拷贝/μL的灵敏度。
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  表现出优异的解析特异性，对非目标禽类病原体无交叉反应。
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  在临床样本评估中与qPCR表现出高度一致性。

引言

禽腺病毒（FAdVs）属于Adenoviridae科Aviadenovirus属，是全球范围内对家禽业造成重大经济损失的重要禽类病原。在已被确认的十二个血清型中[1], [2]，FAdV-4和FAdV-8b分别是水心包炎-肝炎综合征（HHS）和包涵体肝炎（IBH）的主要致病血清型[2], [3], [4]。近年来，这两个血清型在中国及许多其他国家广泛分布，引起严重暴发，导致商业家禽业中死亡率升高、免疫抑制和生长迟缓[1], [5], [6]。由于临床表现与数种其他禽类病毒病存在较大重叠[7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]。研究表明，FAdV-8b可能在水禽中具备垂直传播能力，死亡率范围为10%至30%[14], [15]。值得注意的是，临床表现与其他禽类病毒病相似，因此早期准确诊断和有效疾病防控仍然充满挑战[2], [16]。

近年来，基于等温扩增与CRISPR-Cas系统结合的分子诊断技术因其高灵敏度和优异特异性而受到广泛关注[17], [18]。其中，重组酶聚合酶扩增（RPA）作为一种强大的等温核酸扩增技术，可在37–42 ℃运行，无需热循环设备即可在20–30分钟内快速富集目标。其与粗制生物样本的兼容性以及冻干试剂形式使其便于现场部署，非常适合快速现场检测[19], [20]。尽管基于Cas12的检测方法可以直接识别DNA靶标，而CRISPR/Cas13a系统由crRNA引导，特异性识别靶标ssRNA并激活副反应性反式切割活性。这种信号放大机制赋予了卓越的解析灵敏度，检测限常可达阿摩尔至飞摩尔级别，并可通过荧光报告分子或侧向流读出实现多样化的信号转导，非常适用于即时检测诊断形式。切割荧光报告探针进行放大并产生可检测的放大信号（图2）[19], [21], [22]。RPA与CRISPR/Cas13a系统的结合在保持高灵敏度的同时大幅提高了检测特异性，为病毒核酸的快速和现场可部署检测提供了一种前景广阔的技术策略[23], [24]。

侧向流试纸条（LFA）是一种被广泛采用的即时检测技术，具有操作简便、无需仪器读出和结果可视化判读等优点[25], [26], [27]。LFA使用在5′端标记异硫氰酸荧光素（FITC）、在3′端标记生物素的报告分子。当没有靶核酸时，完整的报告分子会同时被固定在测试线上的金颗粒偶联抗FITC抗体和链霉亲和素捕获，导致金颗粒在测试线上累积。当Cas13a被靶RNA激活后，报告分子被非特异性切割，无法在测试线上被捕获。过量的金颗粒偶联物随后被控制线捕获，产生相应的可视信号。因此，根据测试线和控制线的特征模式判断靶标的存在与否[19], [28]。LFA在CRISPR-Cas检测系统中被广泛采用。通过将CRISPR/Cas13a介导的报告分子切割与试纸条信号读出相结合，实现了对核酸检测结果的快速可视化，为即时检测提供了有力支持[28], [29]。迄今为止，基于CRISPR/Cas13a系统的检测平台已被用于检测多种病毒，包括SARS-CoV-2、坦保苏病毒（TMUV）和DHAV-3[22], [28], [30]。

本研究基于RPA-T7-CRISPR/Cas13a开发了用于快速检测FAdV-4和FAdV-8b的双重分析平台。通过对引物设计、crRNA选择和CRISPR反应条件的系统优化，实现了高灵敏度荧光检测和无需仪器的侧向流读出。所开发方法的解析性能从灵敏度、特异性和临床适用性方面进行了系统评估。该平台为快速兽医诊断提供了实用解决方案，并进一步拓展了CRISPR/Cas13a技术在即时核酸检测中的应用。

章节摘要

病毒株与临床样本

本研究使用的菌株包括腺病毒血清型4（FAdV-4）、腺病毒血清型8b（FAdV-8b）、腺病毒血清型11（FAdV-11）、禽流感H9N2亚型、鸭呼肠孤病毒（DRV）和鸭细小病毒（DPV），均由山东农业大学禽病研究所保存。共获得由中国各地区农场送检的50份组织样本（包括肝脏和脾脏标本）用于潜在感染的临床评估。

RPA-CRISPR/Cas13a检测体系的建立

为了建立一种在临床组织样本中快速准确检测禽腺病毒血清型4（FAdV-4）和禽腺病毒血清型8b（FAdV-8b）的方法，我们开发了一种高度特异和灵敏的基于RPA的CRISPR/Cas13a检测方法（图2）。采用SDS-蛋白酶K-酚/氯仿提取法提取病毒DNA，作为RPA-CRISPR/Cas13a检测体系的反应模板。在存在靶标时，经RPA扩增及T7内

讨论

禽腺病毒仍然是家禽业的重要病原体，因其可引发包涵体肝炎、水心包炎综合征以及造成严重经济损失。因此，快速准确的检测对于疾病监测和及时干预至关重要。基于CRISPR的诊断系统因其在核酸识别和信号放大方面的高度特异性而备受关注。特别是Cas13a在识别靶ssRNA后，

结论

总之，本研究开发的RPA-CRISPR/Cas13a平台为FAdV-4和FAdV-8b的检测提供了一种快速可靠的策略。通过将RPA介导的扩增、基于Cas13a的序列特异性识别以及包括荧光和LFA可视化的双重读出格式相结合，该方法在解析性能和操作简便性之间取得了平衡。临床验证的成功进一步证明了其在快速筛查和初步

CRediT作者贡献声明

陈臻（Zhen Chen）：撰写——初稿、方法论。吴碧榕（Bingrong Wu）：撰写——初稿、调查。于淑敏（Shumin Yu）：验证、调查。张嘉豪（Jiahao Zhang）：验证、调查。刘国成（Guocheng Liu）：验证、调查。貂有祥（Youxiang Diao）：经费获取、概念化。唐毅（Yi Tang）：经费获取、概念化。何大林（Dalin He）：经费获取、概念化。胡京东（Jingdong Hu）：经费获取、概念化。

知情同意声明

本研究不涉及人类受试者。本研究使用的肝脏和脾脏样本均为在取得样本提供者许可后，从鸡的常规疾病诊断过程中收集的残余诊断标本。未针对本研究额外进行动物相关操作。所有涉及动物标本的实验操作均按照山东农业大学批准的动物伦理委员会方案进行。

伦理审批声明

所有与动物相关的操作以及从禽类收集临床样本均按照山东农业大学伦理委员会批准的指南进行（伦理批准号：SDAUA-2025-65）。所有实验操作均符合国家和机构关于动物饲养与使用的有关规定。

利益冲突声明

作者声明，不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究获得山东省重点研发计划（2024TZXD032）、泰山产业领军人才计划（tscx202507031）；中国教育部和农业农村部农业科研体系（CARS-41-19）、山东省自然科学基金（ZR2026QC0169）资助。

Zhen Chen|Bingrong Wu|Shumin Yu|Jiahao Zhang|Guocheng Liu|Youxiang Diao|Yi Tang|Dalin He|Jingdong Hu