《Microbiological Research》：Programmable histone acetylation enables reversible regulation of cellulase production in
Myceliophthora thermophila
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研究人员在 Myceliophthora thermophila 中建立了 CRISPR/dCas9（核酸酶失活Cas9）-p300（人组蛋白乙酰转移酶p300催化核心）系统；多重靶向较单基因座靶向更大程度提高纤维素酶（cellulase）生产；诱导剂撤除后激
研究人员在 Myceliophthora thermophila 中建立了 CRISPR/dCas9（核酸酶失活Cas9）-p300（人组蛋白乙酰转移酶p300催化核心）系统；多重靶向较单基因座靶向更大程度提高纤维素酶（cellulase）生产；诱导剂撤除后激活表型逐渐下降；再诱导（re-induction）恢复调控因子表达和纤维素酶生产。在本研究中，研究人员在嗜热丝状真菌 Myceliophthora thermophila 中建立了可编程 CRISPR/dCas9-p300 组蛋白乙酰化（histone acetylation）系统。靶向关键调控因子 clr-1、clr-2 和 xyr-1 的组蛋白乙酰化协同激活纤维素降解调控网络（cellulolytic regulatory network）并增强纤维素酶生产。通过将诱导型表达（inducible expression）与靶向组蛋白乙酰化结合，研究人员进一步建立了可逆的纤维素酶高产状态（cellulase hyperproduction state），该状态在诱导剂撤除后短暂持续，并可通过再诱导恢复。这些发现表明，可编程组蛋白乙酰化可用于实现丝状真菌内源基因表达的可逆调控。该系统为真菌菌株工程（fungal strain engineering）提供额外方法，并可能有助于提高工业酶生产。
Yao Li、Xiucai Zhao、Xinyu Yang、Jiaxin Wang、Dandan Liu、Qilin Yu、Qian Liu 和 Chaoguang Tian 的论文围绕嗜热丝状真菌 Myceliophthora thermophila 中可编程组蛋白乙酰化调控纤维素酶生产展开。研究背景是，表观遗传机制可在不改变 DNA 序列的情况下调控内源基因表达，其中组蛋白乙酰化（histone acetylation）与转录活跃染色质相关，可影响代谢、环境响应和发育。多数遗传工程依赖永久基因组修饰，限制了对转录状态的可逆和可调控制。CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/dCas9（核酸酶失活Cas9）可程序化招募转录调控因子和染色质修饰蛋白，dCas9 与哺乳动物组蛋白乙酰转移酶 p300 催化核心融合可进行位点特异性组蛋白乙酰化和内源基因激活。丝状真菌是工业酶主要生产者，嗜热真菌适合木质纤维素转化；M. thermophila 具强木质纤维素降解能力和广泛碳水化合物活性酶。已有研究发现 MtCLR-4、Clr-1、Clr-2、Xyr-1、MtFKH1 等调控因子，且染色质调节影响真菌产酶，但以往多依赖染色质调节子的缺失或过表达，改变全基因组活性，难以评估单个调控位点的特定组蛋白修饰。因此，该研究建立 CRISPR/dCas9 组蛋白乙酰化系统，靶向 clr-1、clr-2 和 xyr-1 启动子，考察可编程、可逆激活纤维素降解调控网络和纤维素酶生产。
技术方法概述：研究以 M. thermophila ATCC 42464（MtWT）为亲本，构建 dCas9-p300 表观编辑系统，dCas9 与人 p300 催化核心通过 XTEN80 连接，sgRNA（单链引导RNA）由内源 U6 启动子驱动；编辑模块由 Ptef1 组成型启动子或 Pqa 奎尼酸诱导型启动子表达。靶向 clr-1、clr-2、xyr-1 启动子；用 RT-qPCR（逆转录定量PCR）检测转录，CUT&RUN-qPCR（靶向切割释放核酸酶定量PCR）检测组蛋白 H3 泛乙酰化富集，测定胞外蛋白、CMCase（羧甲基纤维素酶，主要反映内切葡聚糖酶）、pNPCase（以 p-nitrophenyl-β-D-cellobioside 为底物测定纤维二糖水解酶）、xylanase（木聚糖酶）活性及 SDS-PAGE 蛋白谱。用 p300 抑制剂 A-485 和 D1399Y 催化失活 p300 突变验证催化依赖。
研究结果如下。3.1 在 M. thermophila 中建立可编程组蛋白乙酰化编辑器：设计四个 sgRNA 靶向 clr-1 和 clr-2 启动子，发现激活程度依赖靶位。clr-1 T1/T4 增加 2.5/2.1 倍，clr-2 T1/T3 增加 2.9/2.2 倍；ac-Clr1T1 胞外蛋白和 CMCase 达 MtWT 的 146%和136%，ac-Clr2T1 达156%和139%。结论是 dCas9-p300 可按靶位依赖方式激活内源纤维素酶调控因子。3.2 Clr-2 的稳定激活增强纤维素酶生产：将 GFP 替换为 Neo 标记，获取 T1/T3 独立转化子，clr-2 转录增加 2.6–5.2 和 2.4–4.5 倍。第4天胞外蛋白 189–242%，第5天 147–206%；CMCase 第4天 140–206%，第5天 123–188%；pNPCase 第4天 142–197%，第5天 124–172%；SDS-PAGE 主要胞外蛋白条带增强。结论是稳定激活 clr-2 增强纤维素酶生产。3.3 多重组蛋白乙酰化激活纤维素降解调控网络：组合 clr-1 T1、clr-2 T1、xyr-1 T1。诱导 2 h 后 clr-1、clr-2、xyr-1 转录分别升至 2.1–3.0、2.6–5.1、2.5–3.3 倍，4 h 保持；CUT&RUN-qPCR 显示靶启动子组蛋白乙酰化富集较 MtWT 高约 2–3 倍。第3天胞外蛋白 2.8–5.5 倍，CMCase 2.6–3.7 倍，pNPCase 2.0–2.7 倍，xylanase 1.8–2.8 倍；第4天仍高于 MtWT。结论是多重靶向激活调控网络，效果强于单靶点。3.4 dCas9-p300 的转录激活需要 p300 催化活性：A-485 处理多重激活株后，clr-1、clr-2、xyr-1 转录分别下降 22–38%、34–41%、16–29%，胞外蛋白下降 20–43%，CMCase 下降 29–42%；MtWT 受影响小，DMSO 影响小。D1399Y 失活 p300 靶向 clr-2 T1 不增加 clr-2 转录、胞外蛋白和 CMCase。结论是转录激活和产酶增强需要 p300 催化活性。3.5 诱导建立纤维素酶高产状态：使用 Pqa 诱导型 dCas9-p300 和优化 sgRNA，诱导后 clr-1/clr-2 转录增加 2.7–3.5 倍，xyr-1 增加 2.2–3.0 倍；第3天胞外蛋白 311–390%，CMCase 241–264%，第4天分别为 276–309%和198–217%。结论是可诱导建立纤维素酶高产状态。3.6 连续传代中纤维素酶高产状态的持续与恢复：第二代撤除诱导后高产表型仍维持，蛋白第3天 282–366%，第4天 242–274%，CMCase 第3天 218–244%，第4天 180–244%。第三代撤除诱导后明显下降，蛋白第3天 141–172%，第4天 135–162%，CMCase 第3天 110–130%，第4天 109–134%。再诱导第四代恢复，蛋白第3天 247–311%，CMCase 第3天 176–254%，接近连续诱导。结论是高产状态在撤除诱导后短暂持续，传代中逐渐减弱，再诱导可恢复。
讨论部分指出，CRISPR/dCas9 表观编辑已用于丝状真菌，靶向 clr-1、clr-2、xyr-1 启动子增加局部组蛋白乙酰化和转录，但激活幅度因 sgRNA 位置、启动子结构和局部染色质可及性而异。CMCase 和 pNPCase 反映纤维素酶系统不同组分，底物和检测方法不同，绝对活性不可直接比较；Clr-2 调控多个纤维素酶基因，各组分响应不同。高效产酶需要协调调控，CLR-1、CLR-2、XYR-1 构成互连网络，多重激活比单一调控因子激活更有效，但原文不能区分加和与协同作用，需系统比较单、双、三靶组合。与永久遗传改造不同，该策略保留天然 clr-1、clr-2、xyr-1 位点，通过靶向组蛋白乙酰化调节其活性。遗传和化学证据支持 p300 催化活性必要性：无 sgRNA 不激活；D1399Y 催化失活 p300 不激活 clr-2；A-485 抑制 p300 降低三个调控因子表达和产酶，但 A-485 可能影响靶向复合物以外的 p300，故催化失活对照提供更直接证据。可逆性方面，诱导建立高产状态，撤除诱导后短暂持续，连续传代逐渐下降，再诱导恢复。原文强调，这种持续不应解释为组蛋白乙酰化的稳定遗传，且因未逐代测定乙酰化，不能确定持续表型直接反映乙酰化持续。工作模型是 dCas9-p300 招募建立局部乙酰化染色质，协同激活纤维素降解调控网络；撤除诱导后减弱，再诱导恢复。原文还指出，dCas9-p300 的更广泛转录效应尚待确定，因未进行全基因组转录组或染色质分析，不能界定全部转录变化或排除非靶向染色质效应；未来需转录组、全基因组 dCas9 结合和组蛋白乙酰化分析。工程上，可逆表观调控不同于常规基因组编辑，可在不永久修改靶位点的情况下建立、减弱和恢复生产表型，但长期培养和工业发酵中的稳健性仍需测试。
结论翻译：在本研究中，研究人员在嗜热丝状真菌 Myceliophthora thermophila 中建立了可编程 CRISPR/dCas9-p300 组蛋白乙酰化系统。靶向关键调控因子 clr-1、clr-2 和 xyr-1 的组蛋白乙酰化协同激活纤维素降解调控网络并增强纤维素酶生产。通过将诱导型表达与靶向组蛋白乙酰化结合，研究人员进一步建立了可逆的纤维素酶高产状态，该状态在诱导剂撤除后短暂持续，并可通过再诱导恢复。这些发现表明，可编程组蛋白乙酰化可用于实现丝状真菌内源基因表达的可逆调控。该系统为真菌菌株工程提供了额外方法，并可能有助于提高工业酶生产。
