1-氨基芘诱导肾小管上皮细胞衰老经BRD4驱动的衰老相关分泌表型信号激活成纤维细胞

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Renal Tubular Epithelial Cells Senescence Induced by 1-Aminopyrene Activates Fibroblast via BRD4 Driven Senescence-Associated Secretory Phenotype Signaling

　　

摘要专业翻译 流行病学证据将环境污染与慢性肾脏病（CKD）联系起来。然而，柴油来源污染物触发并维持肾纤维化的分子机制仍不清楚。在本研究中，研究人员发现1-氨基芘（1-AP），一种柴油机尾气的代谢产物，可导致基因组不稳定和肾小管上皮细胞（RTEC）衰老。将RTEC暴露于亚细胞毒性浓度的1-AP可引起持续性DNA损伤，如彗星实验和γ-H2AX焦点所证实。持续的DNA损伤激活了p21介导的细胞衰老，随后诱导衰老相关分泌表型（SASP）因子（IL-6、IL-1β、CXCL1、MCP-1和TGF-β1）的表达。来自衰老RTEC的条件培养基促进了肾成纤维细胞的激活和细胞外基质基因的表达，确立了上皮-间充质串扰作为促纤维化信号传导的关键驱动因素。尽管1-AP激活了芳烃受体（AhR），但AhR抑制未能抑制SASP表达和成纤维细胞激活。在表观遗传水平上，1-AP暴露导致RTEC发生染色质重塑，其特征为H3K9乙酰化增加以及H3K9me3和H3K27me3的丢失，促进了表观遗传阅读器BRD4向SASP基因位点的募集。对BRD4的药理学抑制抑制了SASP转录，阻断了成纤维细胞的旁分泌激活，并促进了RTEC的凋亡。因此，BRD4可能是治疗污染相关CKD的潜在治疗靶点。

论文解读

研究背景与科学问题

慢性肾脏病（CKD）是全球范围内导致发病率和死亡率的主要原因之一。肾小管间质纤维化（TIF）是进行性CKD的关键病理特征，也是肾功能下降和预后不良的预测指标。在纤维化进程中，肾小管上皮细胞（RTEC）作为最早受损的细胞类型，其损伤后的修复机制对疾病走向至关重要。严重或持续的损伤可导致RTEC发生适应不良性修复，包括部分上皮-间充质转化（pEMT）和细胞衰老。衰老的RTEC获得衰老相关分泌表型（SASP），持续释放促炎和促纤维化细胞因子，加剧肾脏炎症和纤维化进程。

流行病学研究已将环境污染物，特别是柴油机尾气颗粒物（DEPs），与CKD发病率和进展相关联。1-硝基芘（1-NP）是柴油尾气中富集的硝化多环芳烃，吸入后被代谢为1-氨基芘（1-AP），后者是反映柴油来源毒物内暴露的验证性尿液生物标志物。近期代谢组学研究鉴定1-AP为CKD过程中肾脏内逐渐蓄积的内源性代谢物，且与肾功能下降密切相关。尽管已知1-AP是芳烃受体（AhR）的配体，但其是否直接驱动RTEC功能障碍和促纤维化信号传导尚不清楚。因此，研究人员提出假说：1-AP作为活跃的致病介质，通过BRD4依赖的SASP表达诱导RTEC衰老，进而导致旁分泌成纤维细胞激活和进行性TIF。

研究设计与技术方法

研究人员采用体外细胞模型开展研究。大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）和大鼠肾成纤维细胞（NRK52F）购自印度浦那NCCS。主要技术方法包括：MTT法检测细胞活力；DCFH-DA荧光探针定量细胞内活性氧（ROS）；碱性彗星实验评估DNA损伤；γ-H2AX免疫荧光检测DNA双链断裂；SA-β-gal染色评估细胞衰老；DAPI核染色和Ki67免疫荧光评估细胞增殖状态；实时定量PCR（qRT-PCR）检测衰老相关基因、SASP因子及成纤维细胞激活标志物的mRNA表达；免疫荧光（IF）检测蛋白水平表达；条件培养基（CM）转移实验评估上皮-成纤维细胞旁分泌串扰；TUNEL实验检测细胞凋亡；ELISA定量条件培养基中IL-6和TGF-β1浓度。

研究结果

1-AP以不依赖ROS的方式诱导RTEC基因组不稳定

MTT实验显示，1-AP在100 nM及以下浓度未引起显著细胞毒性，1 μM暴露48小时维持80%以上细胞活力，故选择100 nM和1 μM用于后续功能研究。1-AP显著增加细胞内ROS水平，N-乙酰半胱氨酸（NAC）可有效清除ROS。然而，尽管ROS被有效抑制，NAC共处理未能显著减少彗星实验检测的DNA损伤和γ-H2AX焦点阳性细胞比例，表明1-AP诱导的基因组不稳定在很大程度上独立于氧化应激。

1-AP诱导RTEC衰老并驱动旁分泌成纤维细胞激活

SA-β-gal染色显示1-AP暴露后衰老细胞显著增加，DAPI核染色显示细胞数量减少，Ki67表达下降，提示增殖能力受抑。qRT-PCR显示衰老调控基因p16、p21和p53 mRNA水平上调，p21蛋白水平显著增加。SASP因子IL-6、CXCL1、IL-8、MCP-1和IL-1β表达显著升高。将1-AP处理RTEC的条件培养基应用于NRK52F成纤维细胞后，肌成纤维细胞激活和细胞外基质基因α-SMA、POSTN、COL1A2、TIMP-1和CTGF显著上调，蛋白水平也得到验证。

1-AP激活AhR信号，但AhR抑制不能抑制SASP驱动的旁分泌成纤维细胞激活

1-AP暴露导致AhR核转位增加，并显著诱导经典AhR靶基因CYP1A1和CYP1A2转录，AhR抑制剂可有效阻断该信号。AhR抑制部分降低了p53和p16表达，但未影响p21。关键的是，AhR抑制未能抑制IL-6和TGF-β1等主要SASP介质的诱导。条件培养基转移实验显示，来自1-AP加AhR抑制剂共处理细胞的条件培养基仍能显著激活成纤维细胞，表明AhR阻断不足以抑制SASP介导的旁分泌成纤维细胞激活。

1-AP诱导RTEC向转录许可状态的染色质重塑

免疫荧光分析显示，1-AP暴露显著增加H3K9乙酰化（H3K9ac），同时降低抑制性组蛋白标记H3K9三甲基化（H3K9me3）和H3K27三甲基化（H3K27me3），呈现剂量依赖性。这些协调变化表明染色质向转录许可状态转变，为持续的SASP基因表达提供了表观遗传基础。

BRD4控制SASP表达和成纤维细胞激活

1-AP暴露导致核内BRD4阳性细胞剂量依赖性增加。BRD4抑制剂JQ1（0.5 μM）显著抑制多种SASP因子的mRNA表达，包括IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和CXCL1，但衰老标志物p21仍保持升高，表明BRD4调控分泌表型而非衰老本身。来自1-AP加JQ1处理细胞的条件培养基显著降低成纤维细胞肌成纤维细胞和细胞外基质标志物的表达，免疫荧光验证了α-SMA、POSTN和COL1A1的显著降低。

BRD4抑制抑制SASP而不阻止DNA损伤，将细胞命运转向凋亡

与AhR抑制相比，BRD4抑制有效降低ROS水平，但未减轻DNA损伤反而增加DNA损伤和γ-H2AX阳性细胞。BRD4抑制显著减少SA-β-gal阳性衰老细胞，显著抑制IL-6和TGF-β1表达，并显著增加TUNEL阳性凋亡细胞。p21蛋白阳性细胞在1-AP加JQ1处理后明显减少。这些结果表明，BRD4抑制将基因组不稳定细胞从衰老命运转向凋亡消除。

讨论与结论

本研究将1-AP重新定位为具有生物活性的肾毒性物质，而非仅仅是被动暴露的生物标志物。1-AP诱导的DNA损伤在有效清除ROS后仍持续存在，提示氧化应激并非主要遗传毒性机制，这与临床CKD中抗氧化干预反复失败的现象一致。研究确立了RTEC衰老作为CKD进展驱动因素的角色，衰老RTEC通过SASP介导的旁分泌信号激活成纤维细胞，而非通过上皮细胞转分化为间充质成纤维细胞。

研究的一个关键机制发现是，AhR激活虽是1-AP暴露的生物学上游事件，但一旦RTEC衰老建立，阻断AhR不足以抑制促纤维化SASP轴。SASP维持和旁分泌成纤维细胞激活由持续基因组应激下游的AhR非依赖机制驱动。另一个重要进展是鉴定出1-AP诱导的染色质重塑，即H3K9ac增加伴随H3K9me3和H3K27me3丢失，这种从抑制性向许可性染色质的转变是衰老相关转录重编程的标志。H3K9ac为BRD4提供停靠位点，BRD4在SASP基因位点促进转录延伸。BRD4抑制虽未减轻基因组损伤，但将细胞命运从衰老转向凋亡，提示SASP维持为基因组不稳定细胞提供生存信号。

BRD4抑制在肺、肝和心脏纤维化模型中均显示抗纤维化作用，本研究将该范式扩展至污染诱导的肾纤维化。研究提出，1-AP可能在RTEC中诱导长期表观遗传记忆，使短暂暴露产生持续的促纤维化信号，这可能解释为何CKD在暴露减少后仍持续进展。靶向BRD4的表观遗传治疗策略可能打断这一病理记忆，为污染相关CKD提供新的治疗途径。

研究结论：研究人员鉴定出一条机制轴，即1-AP诱导RTEC基因组不稳定，驱动衰老，并通过H3K9乙酰化依赖的BRD4募集维持SASP转录，导致旁分泌成纤维细胞激活和纤维化重塑。这些发现将1-AP重新定位为活跃的致病介质，并确立BRD4作为污染诱导肾纤维化的关键表观遗传调控因子，其作用独立于持续的AhR信号或氧化应激。靶向BRD4的治疗策略可能代表缓解慢性环境毒物暴露相关CKD进展的新方法。