《Journal of Cell Communication and Signaling》：Dermal fibroblasts cultured from aged human skin display a pro-inflammatory phenotype
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真皮成纤维细胞合成、组织并驻留于真皮细胞外基质（ECM）中，ECM为皮肤提供机械支撑，也是真皮细胞功能所必需的微环境。在衰老过程中，ECM发生碎裂，这种变化与皮肤变薄、脆弱等临床表现以及成纤维细胞功能改变（包括ECM结构基因表达降低和促炎介质表达升高）有关。研
真皮成纤维细胞合成、组织并驻留于真皮细胞外基质（ECM）中，ECM为皮肤提供机械支撑，也是真皮细胞功能所必需的微环境。在衰老过程中，ECM发生碎裂，这种变化与皮肤变薄、脆弱等临床表现以及成纤维细胞功能改变（包括ECM结构基因表达降低和促炎介质表达升高）有关。研究人员探究了衰老皮肤中成纤维细胞的功能改变究竟是反映了对衰老真皮ECM微环境的适应，还是内在的衰老反应。研究人员从年轻（20–30岁；6名女性，6名男性）和年长（>80岁；6名女性，6名男性）供体的防晒部位皮肤中建立了原代真皮成纤维细胞培养体系。两组间早期生长动力学未见差异；然而，来自年长个体的成纤维细胞在大约25次群体倍增后生长速度减慢，最终群体倍增水平降低了20%。在传代前，经过短暂的原代培养（6–8天）后，来自年长供体的成纤维细胞平均端粒长度减少了约1000碱基对（~1 kb）。全局基因表达分析发现了477个差异表达基因（DEGs；校正后p值≤0.05，绝对log2倍数变化≥0.58），其中包括300个上调转录本和177个下调转录本。上调的DEGs及其相关的蛋白质-蛋白质相互作用网络富集于细胞因子和趋化因子介导的信号通路（p < 10?5）。下调的DEGs富集于脂质生物合成和脂肪酸代谢途径。值得注意的是，来自年轻和衰老皮肤的成纤维细胞表达了相似水平的编码ECM结构蛋白的基因，包括胶原蛋白（42个基因）、蛋白聚糖（29个基因）和糖蛋白（157个基因）。这些发现表明，来自衰老皮肤的成纤维细胞在原代培养中保留了促炎转录表型，与其在体内的表型相似。相比之下，来自衰老皮肤的原代成纤维细胞在原代培养中表达了与年轻水平相当的ECM结构基因，这表明体内ECM基因表达的降低反映了对衰老真皮微环境的动态适应，而非合成能力的永久性下降。
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一、研究背景与研究目的
皮肤作为人体最大的器官，其衰老表现为变薄、松弛、皱纹形成以及功能减退，如伤口愈合能力下降和疾病易感性增加。真皮是皮肤的主要力学支撑层，由真皮成纤维细胞合成和维护的细胞外基质（ECM）构成。在衰老过程中，真皮ECM发生进行性丢失和碎裂，同时伴随成纤维细胞功能的改变，包括ECM结构蛋白表达减少、基质降解酶（如MMP1、MMP9）表达升高以及氧化应激增强。已有研究表明，将年轻成纤维细胞置于人工模拟的“衰老”三维胶原基质中会诱导其呈现衰老特征，而将衰老成纤维细胞置于结构完整的ECM环境中则可部分恢复其年轻表型。这提示成纤维细胞的许多衰老特征可能并非严格的细胞自主性过程，而是对ECM微环境变化的适应性反应。然而，当衰老成纤维细胞脱离其原生微环境后，其内在的生长能力和分子特征究竟如何，尚不完全清楚。因此，本研究旨在探究分离自年轻和年长供体防晒部位皮肤的成纤维细胞，在相同的标准原代培养条件下，其基因表达谱、端粒长度和生长特性是否存在本质差异，从而区分哪些特征是细胞固有的，哪些是对微环境的适应性响应。
二、研究方法概述
研究人员从年轻（20–30岁，n=12）和年长（>80岁，n=12）高加索志愿者的防晒部位（臀部）获取4毫米全层皮肤活检样本。通过酶消化法分离真皮成纤维细胞，并进行短时间原代培养（6–8天）。随后采用以下关键技术进行分析：利用Southern印迹端粒限制性片段长度分析法测量端粒长度；通过批量RNA测序（bulk RNA-seq）获取全局基因表达谱，并使用DESeq2软件包进行差异表达基因（DEGs）鉴定；运用clusterProfiler进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape软件的CytoHubba插件识别核心枢纽基因。
三、研究结果
3.1 来自年轻和衰老人类皮肤的真皮成纤维细胞的生长特性
研究发现，在原代培养初期，年轻和年长供体来源的成纤维细胞达到70%汇合所需时间相似，表明早期生长速率无显著差异。在长期连续传代培养的前50天内，两组的群体倍增水平（PDLs）也基本一致。然而，在超过100天的后期培养中，来自年长供体的成纤维细胞增殖能力明显下降，最终总群体倍增水平显著低于年轻组（43 ± 1.5 vs. 53 ± 1.8，p < 0.001），表明衰老成纤维细胞的复制潜能有限。
3.2 端粒长度与转录组分析
在短暂原代培养后，来自年长供体的成纤维细胞平均端粒长度比年轻供体短约1000碱基对（~1 kb）（12 kb vs. 13 kb，p = 0.0016），反映了其在体内累积的复制历史。主成分分析显示，两组样本的转录组图谱存在年龄相关的分离趋势。共鉴定出477个DEGs，其中300个在衰老成纤维细胞中上调，177个下调。层级聚类热图清晰地展示了两个年龄组间不同的转录模式。
3.3 原代真皮成纤维细胞中基质体基因的表达
对包含胶原蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白在内的核心ECM结构基因进行分析，结果显示，在相同的原代培养条件下，来自年长和年轻供体的成纤维细胞对这些基因的表达水平大致相当。这表明，在脱离衰老微环境后，衰老成纤维细胞恢复了合成ECM结构蛋白的转录能力。然而，一部分基质体相关基因，特别是编码基质重塑酶和炎症成分的基因，在衰老成纤维细胞中仍表现出差异性表达。
3.4 功能富集与整合的PPI网络枢纽分析
功能富集分析揭示，在衰老成纤维细胞中上调的DEGs显著富集于免疫和炎症相关通路，包括细胞因子介导的信号传导、TNF信号通路等。PPI网络分析识别出一个由90个基因组成的密集互作簇，其核心枢纽基因包括CCL5、CCL2、CXCL1、CD40、IL15和MMP9，进一步证实了衰老成纤维细胞持久的促炎转录特征。相反，下调的DEGs主要富集于脂质代谢、胆固醇生物合成和脂肪酸代谢通路，其PPI网络的核心枢纽基因包括SREBF1、FASN、SCD和DHCR7，表明衰老成纤维细胞的脂质合成能力受到抑制。
四、讨论与结论
本研究揭示了皮肤成纤维细胞衰老过程中的一个关键分歧：ECM结构基因表达的降低是一种灵活的、依赖于微环境的适应性改变，因为一旦脱离衰老微环境，衰老成纤维细胞便能恢复其合成能力；而促炎转录表型则作为一种相对稳定的细胞记忆，在短期原代培养中持续存在。这一发现支持了“炎性衰老”（inflammaging）的概念，即衰老伴随着慢性的低度炎症。研究认为，衰老成纤维细胞持续分泌基质金属蛋白酶（MMPs）和炎症介质，会促进局部基质降解，而改变的基质结构和力学信号又会反过来强化衰老表型，形成一个正反馈循环。因此，真皮衰老更应被理解为一种稳态应变（allostasis），即生理设定点对环境变化的持续调整。研究结论指出，剖析微环境线索与持久细胞记忆之间的相互作用，对于理解皮肤衰老机制和开发恢复真皮组织弹性的治疗策略具有重要意义。
