《Neurobiology of Disease》：Maternal edible THC consumption alters offspring neurodevelopment and emotional behavior in rhesus macaques
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：母体摄入可食用THC影响恒河猴后代神经发育与情绪行为。产前THC暴露与婴儿期应激和焦虑增加相关；纵向MRI将THC暴露与后代白质发育改变联系起来；研究整合了影像学、行为学、甲基化组和转录组分析；THC相关脑部特征富集于神经发育和突触通路；研究将THC诱导的后
：母体摄入可食用THC影响恒河猴后代神经发育与情绪行为。产前THC暴露与婴儿期应激和焦虑增加相关；纵向MRI将THC暴露与后代白质发育改变联系起来；研究整合了影像学、行为学、甲基化组和转录组分析；THC相关脑部特征富集于神经发育和突触通路；研究将THC诱导的后代脑内分子特征与行为联系起来。研究人员利用恒河猴模型，在孕前、孕期及产后给予母猴含THC（Δ?-四氢大麻酚，delta-9-tetrahydrocannabinol）或安慰剂的食用饼干，并在后代出生后至6月龄期间进行纵向追踪。通过弥散张量成像（diffusion tensor imaging，DTI）评估白质微结构，通过行为学测试评估情绪调节能力，并通过全基因组亚硫酸氢盐测序（whole genome bisulfite sequencing，WGBS）和RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）分析后代前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）和小脑的DNA甲基化及基因表达变化。结果显示，THC暴露后代在6月龄时胼胝体（corpus callosum，CC）及多个白质区域表现出显著升高的各向异性分数（fractional anisotropy，FA）；在P90时更多时间依偎母猴且活动减少，在P120面对陌生人和新奇刺激时发声增多，提示应激和焦虑水平升高。分子层面，小脑和PFC中分别鉴定出1867和2109个差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMRs），富集于神经发育和突触功能相关通路，其中338个基因在两个脑区共同差异甲基化，42个为自闭症谱系障碍候选基因。小脑中鉴定出8个FDR显著差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），且多个DEG与DMR存在显著表达-甲基化关联（expression quantitative trait methylation，eQTM）。加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）进一步将THC相关基因模块与影像学和行为学表型关联起来。该研究通过多模态整合分析，揭示了产前THC暴露影响后代神经发育的潜在表观遗传和转录机制，为理解孕期大麻使用的长期神经发育风险提供了重要转化证据。
论文解读
一、研究背景与意义
随着大麻在多个州合法化，其在育龄人群中的使用日益普遍，孕期大麻使用已成为最常见的联邦非法物质暴露之一。尽管美国妇产科学会明确建议孕期避免大麻使用，但许多女性在孕前、孕期及产后仍持续使用，尤其是食用型大麻产品，导致后代面临慢性大麻暴露风险。Δ?-四氢大麻酚（delta-9-tetrahydrocannabinol，THC）作为大麻的主要精神活性成分，可结合胎盘和发育中胎儿的CB1和CB2大麻素受体，而内源性大麻素系统对神经发育至关重要，因此孕期外源性大麻素暴露可能对胎儿神经发育产生不利影响。现有流行病学研究提示产前大麻暴露与胎儿生长受限、早产、死产及后代神经发育改变相关，但人类研究受自我报告偏差、混杂因素多、样本量小及无法探究生物学机制等限制。为克服这些局限，研究人员此前建立了慢性每日食用THC的恒河猴转化模型，恒河猴与人类在基因组、解剖、生殖生理、发育时序、胎盘结构和THC代谢方面高度相似。前期研究已发现产前THC暴露与胎儿脑生长异常、脑组织学改变及胎盘和胎儿多个器官DNA甲基化改变相关，但尚不清楚这些胎儿期不良发现是否能预测后代长期的神经发育健康。因此，本研究旨在利用该模型纵向追踪至后代6月龄，通过整合神经影像、行为学和分子生物学多模态评估，探究母体THC使用对婴儿神经发育和行为的影响及其潜在生物学通路。
二、研究设计与主要方法
研究人员使用此前已建立的恒河猴模型，4只雌性恒河猴每日接受含THC的食用饼干（初始剂量0.5 mg/7kg/天，约4个月内逐步滴定至2.5 mg/7kg/天），4只接受安慰剂饼干，孕前约4个月开始给药，贯穿孕期和产后。所有动物经时间交配后自然分娩，每组各含1只雄性、3只雌性后代。主要技术方法包括：在孕G110和G155进行胎儿T?加权MRI评估脑体积发育；在出生后P30和P180进行T?和弥散加权MRI（diffusion-weighted MRI，DW-MRI），通过基于纤维束示踪的空间统计（tract-based spatial statistics，TBSS）和感兴趣区（region of interest，ROI）分析评估白质各向异性分数（fractional anisotropy，FA）；在P1至P90多个时间点对母-婴互动进行远程行为编码；在P120进行人类入侵者测试（Human Intruder Test，HIT）和新奇物体测试（Novel Objects Test，NOT）评估情绪调节；采集P30和P180毛发检测皮质醇水平；后代6月龄时处死取脑，进行组织病理学和多重免疫组化（multiplex immunohistochemistry，mIHC）检测Iba-1（小胶质细胞标志）、NeuN（神经元标志）、GFAP（星形胶质细胞标志）和Ki67（增殖标志）；对前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）和小脑进行全基因组亚硫酸氢盐测序（whole genome bisulfite sequencing，WGBS）和RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）；通过表达数量性状甲基化（expression quantitative trait methylation，eQTM）分析和加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）进行多模态数据整合。
三、研究结果
3.1 产前THC暴露与婴儿脑白质FA升高相关
P30时两组间全脑体素白质FA无显著差异。P180时，THC暴露后代在多个白质区域（包括上纵束额极、左侧半卵圆中心和胼胝体）表现出显著高于对照的FA值。胼胝体亚区ROI分析显示，治疗与年龄存在显著交互作用，P180时THC组胼胝体总体及压部（genu）FA显著升高，P30时无组间差异。
3.2 产前THC暴露与脑体积差异无关
在G110、G155、P30和P180四个时间点，全脑及皮层灰质、白质、皮层下灰质、脑室、脑干和小脑体积在两组间均无显著差异。
3.3 THC暴露婴儿表现出应激和焦虑增加的行为学证据
行为学分析发现治疗与年龄对婴儿依偎母猴时间存在显著交互作用。P90时THC组婴儿依偎母猴时间显著增加（69.37%±14.97 vs 13.99%±14.97，p=0.0007），活动量显著减少（18.11%±6.13 vs 43.16%±6.13，p=0.03），哺乳时间有增加趋势但未达显著。P120情绪调节测试中，THC组婴儿在面对新奇或潜在威胁刺激时发声时间百分比显著增加，适应期发声无组间差异。P180毛发皮质醇在THC组有升高趋势但未达统计学显著。
3.4 脑组织病理与免疫组化改变
THC组4只婴儿中有2只在额叶皮层观察到罕见的小胶质结节，对照组无此发现。多重免疫组化未检测到组间显著差异，但THC组PFC白质Iba-1染色有增加趋势（0.62%±0.1 vs 0.37%±0.1，p=0.13），小脑分子层GFAP染色面积有减少趋势（9.29%±4.17 vs 18.32%±4.17，p=0.18），与前期胎儿研究结果一致，提示潜在的小胶质细胞激活。
3.5 脑DNA甲基化与基因表达改变
WGBS分析在小脑鉴定出1867个DMRs（1102个高甲基化、765个低甲基化），排名靠前的DMRs注释到TLX3（T细胞白血病同源盒3）、NR2F2（核受体亚家族2F组成员2）和EN1（engrailed同源盒1）等神经发育关键基因。GO富集分析显示小脑DMRs最显著富集于前脑发育相关通路。PFC鉴定出2109个DMRs（60%高甲基化），富集于突触组织和功能及炎症过程。两个脑区共有338个基因差异甲基化，显著高于随机预期（p=3.2e-49），其中42个为自闭症谱系障碍候选基因（SFARI数据库）。65个DMRs在两个脑区覆盖相同基因组坐标，30个高度保守，其中OPRM1（μ阿片受体1）DMR甲基化水平与P120发声次数显著相关（r=0.91，p=0.005）。RNA-seq在小脑鉴定出8个FDR显著DEGs（5个上调、3个下调），PFC无FDR显著DEGs。小脑DEGs富集于神经发生调控和轴突损伤应答等生物过程；按方向分层分析显示，上调基因富集于血管收缩、细胞外基质组织和形态发生，下调基因富集于突触结构和离子通道复合物。
3.6 多模态数据整合
eQTM分析显示，1006个小脑候选DEGs中806个与至少一个CpG位点甲基化显著相关，排名前10的DEGs中OTX2、TLX3和NR2F1同时注释到top DMR基因且为显著eQTM基因。跨域相关性分析发现，PFC白质Iba-1染色百分比与P90哺乳时间（r=0.94，p=0.0005）、依偎母猴时间（r=0.71，p=0.048）和P120发声（r=0.79，p=0.02）正相关，与活动量负相关（r=?0.72，p=0.043）。6月龄胼胝体峡部FA与P90依偎母猴时间和P120发声正相关（r=0.72，p=0.044；r=0.75，p=0.033），与小脑分子层GFAP百分比负相关（r=?0.76，p=0.029）。WGCNA在小脑鉴定出51个表达模块，4个模块与THC暴露显著相关（MEgrey60、MEmagenta、MEgreenyellow、MElightyellow），其中MEgrey60同时与P120发声和P90活动量相关，MEmagenta与6月龄FA测量最相关且富集于脑血管疾病相关基因，MEviolet虽未达显著但与THC治疗（bicor=?0.72，p=0.063）及多个行为、影像和组织学指标相关。
四、讨论与结论
本研究通过纵向追踪至6月龄的恒河猴模型，整合产前产后MRI、行为学测试和死后组织学及全基因组分子分析，发现产前THC暴露虽未导致脑体积改变，但在6月龄时胼胝体等白质区域FA显著升高，且THC暴露婴儿表现出更多依偎母猴和面对新奇刺激更多发声的行为，提示应激和焦虑水平升高。脑体积无差异可能与样本量小（每组3雌1雄）及仅两个胎儿时间点导致检验效能不足有关，也与人类ABCD研究（7千余参与者）发现产前大麻暴露与9-11岁颅内体积变化较小相关。FA升高可能反映白质结构组织或成熟度的差异而非完整性改变，因为恒河猴胼胝体轴突从出生到第6个月显著减少且髓鞘化尚未完成，这一模式与成人医用大麻使用者中观察到的FA升高一致，但与ABCD研究中儿童（平均9.9岁）FA降低的结果不同，差异可能源于剂量、频率、使用方式、暴露年龄和MRI年龄等设计差异。分子层面，小脑和PFC均存在大量DMRs，富集于神经发育和突触通路，且两个脑区共有338个差异甲基化基因，其中42个为自闭症候选基因，提示THC暴露对神经发育相关基因的表观遗传调控具有跨脑区保守性。小脑DEGs富集于神经发生调控和轴突损伤应答，eQTM分析进一步揭示了OTX2、TLX3、NR2F1等关键神经发育基因的甲基化-表达关联。WGCNA将THC相关基因模块与行为、影像和组织学表型联系起来，特别是MEviolet模块同时关联THC暴露、P90行为、P120发声、6月龄FA和小脑GFAP，提示存在连接分子改变与神经发育表型的共调控基因网络。该研究首次在非人灵长类模型中整合多模态数据，将产前THC暴露相关的脑内分子特征与行为表型联系起来，为理解孕期大麻使用的长期神经发育风险提供了重要转化证据。
