急性脑切片单细胞与网络电压成像：一份更新指南

《Neuroscience》：Single-cell and network voltage imaging in acute brain slices: an updated guideline

本综述旨在为脑切片中的电压成像提供一份指导手册。研究人员探讨了不同方案以构建最合适的策略，详细分析了各方案的技术优势与局限性，并讨论了实施过程中需考虑的实际因素。急性脑切片是最常用的离体（ex-vivo）神经科学模型，结合了体外（in-vitro）培养的诸多实际优势，同时保留了完整活脑的重要特征。其平面几何结构允许使用水浸物镜进行直接光学观察，嵌入自然环境的活细胞（包括部分原始回路）可通过直立式显微镜从顶部进行电生理测量。若在显微镜上加装落射荧光单元，还可通过电压成像监测上层表面的神经元电活动。与电极进行的膜电位（Vm）测量相比（受限于电极数量），电压成像的潜在限制仅在于记录设备的分辨率，例如使用相机时的像素数。这种独特的成像能力可在脑切片中于两种空间尺度上应用：单细胞尺度，用于记录来自轴突、树突或突触等神经元亚区室的Vm信号；以及网络尺度，用于监测神经元群体的Vm变化。脑切片中的电压成像最初使用有机电压敏感染料（VSDs），通过组织胞外染色或用膜片钳电极将水溶性指示剂注入神经元来实现。技术上，前者通过光电二极管阵列监测Vm变化实现网络成像，后者则允许解析来自轴突或树突棘等微小神经元亚区室的Vm瞬变。随后，基因编码电压指示剂（GEVIs）的发展使得无需细胞染色即可表达探针，并能靶向特定细胞类别。值得注意的是，使用GEVIs进行电压成像不涉及染色步骤，原则上可在单细胞尺度和网络尺度上进行。本综述聚焦于脑切片中的电压成像，鉴于近年来在多个方向取得的一系列关键进展，包括有机VSDs和GEVIs在亮度、响应速度和灵敏度上的改进，提升时空分辨率的新型相机，以及更复杂成像方法（如双光子（2P）和计算机生成全息术）的应用。本文旨在提供一个简短指南，帮助选择最佳策略以实现特定类型的测量，同时应对电压成像的困难与限制。除了空间和时间分辨率以及光学配置等技术方面，本文还讨论了实验执行中的实际限制，如成本与现有基础设施的关系、简易性与所需时间，以及操作者的经验水平。如图1所示，电压成像使用者面临多项选择：（1）使用有机VSD还是GEVI；（2）使用宽场照明和相机成像，还是其他提供更高分辨率或性能的方法；（3）探索诱发的Vm信号还是自发性的电活动；（4）关注来自已鉴定神经元（包括亚细胞区室）的Vm信号，还是来自神经元群体和网络的信号。本文将审视所有这些挑战，以协助研究者为其实验目标选择最合适的电压成像策略。

研究背景与问题提出

电压成像技术是神经科学研究中一项重要的功能成像手段，能够在高时空分辨率下监测神经元及其网络的膜电位（V_m）动态变化。急性脑切片作为最经典的离体（ex-vivo）模型，兼具体外实验的操作便利性和体内组织的结构完整性，为电压成像提供了理想的平台。然而，电压成像技术在脑切片中的应用面临多重选择与挑战，包括如何选择合适的荧光探针、光学系统、刺激模式以及记录尺度。这些选择直接影响实验的可行性、数据质量以及科学问题的解答深度。因此，研究人员撰写此篇综述，旨在为计划开展脑切片电压成像的研究人员提供一个全面、实用的决策指南，帮助他们根据自身实验目标和资源条件，构建最优化的实验策略。

研究内容、结论与意义

研究人员系统地梳理了脑切片电压成像领域近年来的关键技术进展，并从四个核心决策维度出发，对各项技术的优缺点、适用场景及实践限制进行了深入分析与比较。最终得出结论：没有一种放之四海而皆准的通用方案，最佳策略的选择必须基于具体的研究问题，并在技术性能（如时空分辨率）、实际操作难度（如所需专业技能、时间成本）、基础设施投入（如动物设施、高端显微成像系统）以及实验通量之间寻求平衡。这项工作的重要意义在于，它为非电压成像领域的神经科学家和生物医学研究者提供了一个清晰的路线图，有助于降低该技术的入门门槛，推动其在基础神经生物学机制研究以及药物筛选、疾病模型表征等转化医学领域的广泛应用。

关键技术方法

研究人员为开展此项系统性指南研究，主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   有机电压敏感染料（VSDs）与基因编码电压指示剂（GEVIs）的比较分析：评估了两种主流荧光探针在易用性、细胞类型特异性、亚细胞结构标记能力、光谱兼容性、绝对校准可能性及时间分辨率等方面的差异。其中，GEVIs的表达依赖于在活体动物中进行腺相关病毒（AAV）注射或使用转基因小鼠品系。
2. 2.
   宽场成像与高分辨率成像方法的对比：分析了标准宽场相机成像、共聚焦显微镜、双光子（2P）显微镜、随机访问多光子显微镜（RAMP）、计算机生成全息术等多种光学系统的原理、空间分辨率、信噪比（SNR）、光毒性和光漂白特性。
3. 3.
   诱发信号与自发信号记录策略的评估：讨论了针对诱发性电活动（如电流注入、电刺激、光遗传学刺激）的触发式采集方案，与针对自发活动的连续长时间记录方案之间的权衡，涉及光照时长、光损伤、信噪比和数据存储量等问题。
4. 4.
   单细胞染色与全脑片染色的VSD应用方案：介绍了通过膜片钳电极向单个神经元内注射VSD以实现亚细胞分辨率的精细方法，以及通过浴液孵育对整个脑片进行快速染色的高通量网络活动监测方法。

研究结果

1. 有机VSDs与GEVIs的选择

研究发现，有机VSDs操作简便，尤其适用于全脑片染色，但实现单细胞分辨率需要熟练的电生理技术进行细胞内注射。GEVIs的核心优势在于其遗传靶向性，可实现对特定细胞类型的记录，但其应用依赖于动物病毒注射或转基因品系饲养等前期工作。在光谱方面，已有多种颜色的VSDs和GEVIs可供选择，便于与其他光学技术（如钙成像、光解笼锁）联用。在时间分辨率上，传统的苯乙烯基VSDs能线性跟踪所有生理范围内的V_m变化，而新型GEVIs也已能够区分动作电位（AP）和阈下信号。对于绝对V_m校准，VSDs可通过已知幅度的参考信号实现，而GEVIs则可通过荧光寿命成像（FLIM）实现。

2. 宽场成像与高分辨率方法的选择

宽场成像与相机记录是最直接、最容易集成到商用显微镜中的方案。其理论空间分辨率受衍射极限限制，但在脑片中，由于深层组织的光散射，实际分辨率会进一步下降。为提高空间分辨率，共聚焦显微镜因使用针孔阻挡了大量荧光，导致信噪比（SNR）过低，难以满足高速电压成像的需求。相比之下，双光子（2P）激发因其不排斥光子的特性，能在单次试验中记录到树突棘水平的V_m信号，但需注意光漂白和光毒性问题。随机访问多光子显微镜（RAMP）和计算机生成全息术等先进方法，可以在提高空间精度的同时记录大量位点，但通常需要更高的专业知识和基础设施投入。

3. 诱发与自发信号记录的选择

对于诱发性信号，可以采用短时程、高强度光照的触发式采集方案，并可通过对多次一致反应的试次进行平均来提高信噪比（SNR）。而对于自发活动，需要长时间的连续记录，这会导致严重的光漂白和光损伤。尽管采用明亮的GEVIs（如ArcLight和Bongwoori）并结合适度的LED照明，可以实现秒级时长的记录，但RAMP等扫描显微镜通过在每点减少有害光照，更适合长时程记录。此外，长时间多部位记录会产生TB级别的大数据集，需要大容量存储系统和高效的数据压缩或降噪算法。

4. 单细胞与全脑片染色的选择

若需解析单个神经元亚区室（如轴突初始段AIS、树突棘）的信号，必须采用繁琐的单细胞VSD注射技术，这要求操作者具备丰富的电生理经验，且耗时较长。而全脑片染色是一种快速简便的方法，能在短时间内获得稳定的荧光信号，并记录来自未知神经元群体的网络活动，适合高通量的筛选研究。两种方法在采样速率（可达20 kHz）、光强、空间分辨率和试次平均次数之间存在不同的权衡取舍。

讨论与结论

研究人员指出，选择最合适的方法需要在技术层面与实际考量（如成本、可用基础设施和专业技能）之间取得平衡，但最终决定应基于待解决的科学问题。没有任何单一方法是普遍优越的。电压成像最初被构想为理解神经元和大脑行为的工具，如今它还可用于表征动物模型或筛选治疗性药物。正是这些生物医学应用，使得脑切片电压成像显得尤为重要，也使这份面向非专业人士的指南变得十分有用。研究人员认为，如今利用现有设备和经过培训的技术人员的专业知识，或在具备脑片电生理经验的工业实验室中，进行电压成像已是可行的。这篇综述旨在预见这些潜在新用户需要面对的挑战，并帮助他们找到最适合的策略。