多系统萎缩中壳核和小脑白质CCR2免疫阳性髓系细胞增多并伴血脑屏障破坏

《Neuroscience Letters》：Increased CCR2-immunopositive myeloid cells in the putamen and cerebellar white matter with blood–brain barrier disruption in multiple system atrophy

　　

多系统萎缩（MSA）是一种进行性神经退行性疾病，特征为帕金森综合征、小脑性共济失调和自主神经功能障碍。近期，研究已发现神经炎症与MSA发病机制密切相关。MSA小鼠模型研究提示，外周型髓系细胞和内源性小胶质细胞可促进MSA中的神经炎症。然而，它们在MSA发病机制中的不同作用仍不清楚。研究人员对来自MSA患者和年龄匹配对照者尸检获得的脑组织进行了免疫组化分析，以针对CCR2（单核细胞谱系细胞表达的趋化因子受体）、TMEM119（跨膜蛋白119，小胶质细胞标志物）和纤维蛋白原（fibrinogen，用于血脑屏障（BBB）渗漏）的抗体检查壳核和小脑白质。与对照者相比，MSA患者这两个区域中CCR2免疫阳性面积均显著增加（壳核，p = 0.0043；小脑白质，p = 0.0438）；然而，TMEM119免疫阳性面积未显示显著组间差异（壳核，p = 0.4220；小脑白质，p = 0.8152）。壳核和小脑白质中CCR2免疫阳性区域的密度呈正相关（Pearson’s r = 0.7325，p = 0.0248）。在壳核中，纤维蛋白原免疫反应性和血管周围渗漏增加，并显示与CCR2免疫染色相似的分布（p = 0.0398）。这些发现提示，在BBB功能障碍区域，CCR2免疫阳性髓系细胞积聚可能涉及外周单核细胞谱系细胞的募集。

研究背景与问题：多系统萎缩（MSA）是一种进行性神经退行性疾病，表现为帕金森综合征、小脑性共济失调和自主神经功能障碍。其特征性病理改变为少突胶质细胞内错误折叠的磷酸化α-突触核蛋白（α-synuclein）积聚，形成胶质细胞胞质包涵体（GCIs），并在基底节、脑桥、小脑、下橄榄核和黑质等特定区域出现神经元丢失和脱髓鞘。MSA主要分为多系统萎缩-小脑型（MSA-C）和多系统萎缩-帕金森型（MSA-P），二者表型可随时间重叠。MSA进展较帕金森病更快，总体病程约9年，目前缺乏有效疾病修饰治疗，且对左旋多巴反应通常较差。虽然磷酸化α-突触核蛋白积聚被认为影响神经元丢失和脱髓鞘，但确切发病机制尚未完全阐明。近年来，神经炎症（neuroinflammation）被认为与MSA发病机制密切相关，炎症介质、巨噬细胞和T细胞积聚在受累区域已有报道，但MSA患者神经炎症细节仍不清楚。脑实质内存在两类巨噬细胞：一类为外周型髓系细胞，包括单核细胞衍生巨噬细胞（MDMs），在神经炎症时由骨髓产生、以单核细胞形式释放入血并跨血管内皮浸润脑实质；另一类为脑内驻留巨噬细胞，即胚胎期卵黄囊来源的小胶质细胞（microglia）。MSA小鼠模型研究提示外周型髓系细胞和小胶质细胞均促进神经炎症，但既往报道多未严格区分MDMs和小胶质细胞，因此二者在MSA患者神经炎症中的不同作用和机制仍不明确。基于此，研究人员开展本项研究，检测MSA患者尸检脑组织中CCR2（趋化因子受体2）免疫阳性髓系细胞和TMEM119（跨膜蛋白119）免疫阳性小胶质细胞的分布和密度，并探讨其与血脑屏障（BBB）破坏的关系。研究结果提示CCR2免疫阳性髓系细胞在壳核和小脑白质显著增加，且与BBB功能障碍区域相关，支持外周免疫机制可能参与MSA发病，具有提示后续治疗策略探索的意义。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究使用尸检脑组织，来源于京都大学脑库，纳入9例MSA患者（MSA-C 6例，MSA-P 3例）和9例年龄匹配疾病对照（包括肌萎缩侧索硬化（ALS）、吉兰-巴雷综合征（GBS）、阿尔茨海默病（AD）、重症肌无力（MG）、肉芽肿性多血管炎（GPA）和额颞叶变性（FTLD）），无神经正常尸检对照。对基底节和小脑层面脑块进行石蜡包埋，采用单标免疫组化检测CCR2、TMEM119、纤维蛋白原和磷酸化α-突触核蛋白（p-Syn），双标免疫组化检测CCR2与Iba1（离子钙接头蛋白1，小胶质细胞/巨噬细胞标志物）或TMEM119。在壳核和小脑白质各取6个非重叠视野，20×物镜，每视野面积0.569 mm²，每例分析3.41 mm²，每区域总计61.4 mm²，使用FIJI/ImageJ进行颜色反卷积、二值化并计算免疫阳性面积密度。统计采用Shapiro-Wilk检验、Welch t检验、Mann-Whitney U检验、Hedges’ g、Pearson和Spearman相关分析。

研究结果：
壳核中CCR2和TMEM119免疫染色：通过免疫组化定量分析，MSA患者壳核CCR2免疫阳性面积较对照显著增加（均值差 = 0.567，95% CI 0.234–0.900；Hedges’ g = 1.75，95% CI 0.684–2.82；Welch’s t检验，p = 0.0043），Mann-Whitney U检验仍显著（p = 0.0011），排除AD和ALS病例后仍显著（Welch’s t检验，p = 0.0032；Mann-Whitney U检验，p = 0.011）。这些细胞呈激活形态、阿米巴样和吞噬性，主要分布于壳核后外侧，其他区域较少；对照组中此类阿米巴样细胞稀少。MSA-C与MSA-P组间壳核CCR2免疫阳性面积无显著差异（Welch’s t检验，p = 0.5133）。壳核TMEM119免疫阳性面积在MSA患者与对照间无显著差异（均值差 = -0.00189，95% CI ?0.00678–0.00299；Hedges’ g = 0.371，95% CI ?0.519–1.26；Welch’s t检验，p = 0.4220），两组细胞均呈分支状形态，提示为小胶质细胞。

CCR2与Iba1或TMEM119双标：通过在一个代表性MSA病例壳核进行双标免疫组化，CCR2与Iba1双标显示大多数CCR2免疫阳性细胞也呈Iba1阳性，且呈特征性阿米巴样形态，不同于典型驻留小胶质细胞的分支状外观。CCR2与TMEM119双标显示二者分布互斥，CCR2阳性细胞一致为TMEM119阴性，TMEM119阳性细胞不表达CCR2。

小脑白质中CCR2和TMEM119免疫染色：通过免疫组化定量分析，MSA患者小脑白质CCR2免疫阳性面积高于对照（均值差 = 0.282，95% CI 0.0100–0.554；Hedges’ g = 1.07，95% CI 0.118–2.03；Welch’s t检验，p = 0.0438），Mann-Whitney U检验仍显著（p = 0.0006），排除AD和ALS病例后仍显著（Welch’s t检验，p = 0.0436；Mann-Whitney U检验，p = 0.011）。CCR2免疫阳性细胞呈阿米巴样吞噬性巨噬细胞样形态，类似壳核。TMEM119免疫阳性面积在两组间无显著差异（均值差 = 0.00297，95% CI ?0.02371–0.02965；Hedges’ g = 0.107，95% CI ?0.774–0.988；Welch’s t检验，p = 0.8152）。小脑皮质中可检测到TMEM119免疫阳性细胞，但差异不显著；CCR2免疫阳性细胞在小脑皮质稀少。MSA-C与MSA-P组间小脑白质CCR2免疫阳性面积无显著差异（Welch’s t检验，p = 0.2570）。

壳核与小脑白质CCR2免疫阳性面积相关性：通过相关性分析，壳核和小脑白质CCR2免疫阳性区域平均密度呈正相关（Pearson’s r = 0.7325，p = 0.0248）。Spearman秩相关显示类似趋势但未达统计学显著性（Spearman’s ρ = 0.5667，p = 0.1116），可能反映小样本统计效能有限。

纤维蛋白原免疫染色评估BBB完整性：通过壳核纤维蛋白原免疫染色，MSA患者纤维蛋白原免疫反应性密度显著增加（均值差 = 0.0949，95% CI 0.00546–0.184；Hedges’ g = 1.07，95% CI 0.119–2.03；Welch’s t检验，p = 0.0398；Mann-Whitney U检验，p = 0.0341）。排除AD和ALS病例后差异不再显著（Welch’s t检验，p = 0.0934）。纤维蛋白原免疫反应性主要见于壳核后外侧，常呈阿米巴样巨噬细胞样外观，总体染色模式和区域分布与CCR2免疫染色相似。MSA患者血管周围可见明显纤维蛋白原渗漏，对照组未见。MSA-C与MSA-P组间壳核纤维蛋白原免疫阳性面积无差异（Welch’s t检验，p = 0.781）。壳核CCR2免疫阳性面积与p-Syn及纤维蛋白原免疫阳性面积均无显著相关。

讨论部分总结：讨论指出，本研究发现MSA患者壳核和小脑白质CCR2免疫阳性髓系细胞显著增加，且两个区域密度正相关，提示其可能在易感区域平行积聚，但小样本下相关性需谨慎解释。CCR2在人类和小鼠经典单核细胞中高表达，并通过CCL2在中枢神经系统炎症部位招募外周单核细胞，因此CCR2免疫阳性细胞在血管周围积聚与外周单核细胞谱系细胞募集一致，可能形成MDMs，并与BBB功能障碍相关。然而，CCR2表达在炎症条件下未必完全限于MDMs，单独CCR2免疫反应性不能确定人尸检组织中髓系细胞来源；双标显示CCR2与TMEM119互斥，支持CCR2阳性细胞不同于TMEM119阳性稳态小胶质细胞，并符合外周单核细胞谱系细胞募集，但确定细胞起源超出本研究范围。这些外周型髓系细胞富集于血管周围纤维蛋白原渗漏区域；由于研究为横断面设计，不能确定时间与因果关系，空间关联提示但不证明BBB功能障碍促进外周型髓系细胞募集。TMEM119免疫阳性面积无显著差异不排除小胶质细胞功能参与，因为TMEM119被视为稳态小胶质细胞标志物，激活状态下表达可能改变。既往研究提示驻留小胶质细胞和MDMs在神经炎症中可能动态相互作用，外周巨噬细胞可通过细胞因子信号影响小胶质细胞活化，小胶质细胞可通过CCL2等趋化因子调节单核细胞募集，命运图谱研究显示浸润巨噬细胞可长期存留并与驻留小胶质细胞相互作用。既往研究还显示MSA患者血清和脑脊液中炎症细胞因子和趋化因子增加，受累区域激活小胶质细胞和T细胞积聚，其中CCL2作为CCR2配体可能参与外周单核细胞谱系细胞募集。Williams et al. 报道在α-Syn过表达小鼠模型中，TMEM119阳性小胶质细胞和CCR2免疫阳性外周型髓系细胞增加。BBB破坏在MSA中已有报道，包括补体激活导致纤维蛋白原渗漏入脑桥、脑脊液/血清白蛋白比值升高。本研究虽未发现TMEM119免疫阳性面积差异，但CCR2免疫阳性细胞明显增加并与血管周围纤维蛋白原渗漏相关，提示外周型髓系细胞浸润可能是MSA相关炎症机制。总体而言，研究强调不仅小胶质细胞，外周型髓系细胞在MSA神经炎症中亦重要，并提示外周免疫系统可能参与MSA发病。局限性包括观察性研究难以确定神经炎症与神经退行性变的时间因果关系，不清楚外周型髓系细胞浸润是α-Syn积聚的继发反应还是炎症驱动病理改变。部分研究表明神经炎症主要与MSA发病相关。在MSA模型中，药物调节小胶质细胞和其他髓系谱系细胞结果不一：抑制髓过氧化物酶（MPO）可改善运动表现，并在纹状体、黑质、小脑皮质、脑桥核和下橄榄核提供神经保护，同时减少小胶质细胞活化和α-Syn负担；通过阻断集落刺激因子1受体（CSF1R）清除髓系细胞可延长生存但恶化特定运动表型，提示固有免疫细胞作用具有时间、区域和细胞类型依赖性；FTY720可增加胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）表达，恢复线粒体功能和行为，减少α-Syn积累和炎症信号。与既往实验研究一起，本研究支持神经炎症通路包括外周型髓系细胞募集可能促进MSA发病。虽然MSA模型证据有限，但抑制CCR2阳性外周型细胞募集已报道可减轻脑缺血小鼠模型神经功能恶化，因此调节这些通路可能作为潜在治疗策略进一步研究，但本研究不能建立因果，需更多机制研究。

研究结论翻译：在本研究中，研究人员证明MSA患者壳核和小脑白质中CCR2阳性髓系细胞显著增加，而TMEM119阳性面积在MSA患者与对照之间无差异；然而，这并不排除小胶质细胞的功能参与。外周型髓系细胞积聚与血管周围纤维蛋白原渗漏相关，提示BBB破坏可能促进其浸润至脑实质。这些发现支持MSA中存在涉及外周巨噬细胞募集的炎症机制的可能性。进一步研究外周型细胞浸润的时机、调节和功能作用，可能有助于开发靶向外周免疫激活的新型治疗方法。