《Neurotherapeutics》：MuSK agonistic antibody has therapeutic potential for MuSK antibody-positive myasthenia gravis
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肌肉特异性酪氨酸激酶（MuSK）抗体阳性重症肌无力（MG）由MuSK自身抗体引起，这些抗体破坏神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体簇集，导致肌无力并常引发严重的肌无力危象。鉴于传统免疫抑制剂和类固醇疗法对MuSK-MG患者的疗效有限，研究人员积极探索了新的治疗方法。在
肌肉特异性酪氨酸激酶（MuSK）抗体阳性重症肌无力（MG）由MuSK自身抗体引起，这些抗体破坏神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体簇集，导致肌无力并常引发严重的肌无力危象。鉴于传统免疫抑制剂和类固醇疗法对MuSK-MG患者的疗效有限，研究人员积极探索了新的治疗方法。在本研究中，研究人员探究了MuSK激动性抗体作为一种新型治疗工具，在存在不同水平自身抗体的情况下恢复MuSK信号传导的潜力。研究人员获得了结合MuSK的Fz结构域的MuSK激动性抗体。该抗体的功效在MuSK-MG小鼠模型中得到了验证。研究人员评估了在来自12名MuSK-MG患者的血清中存在自身抗体的情况下，MuSK激动性抗体恢复MuSK信号的效果。研究人员发现，在某些病例中，随着血清浓度的增加，MuSK激动性抗体对MuSK信号的恢复呈下降趋势。研究结果表明，为了未来MuSK激动性抗体的临床开发，有必要识别那些对该抗体反应良好的患者，或者开发一种辅助疗法以降低自身抗体水平。这将有助于减轻高浓度自身抗体的MuSK-MG患者使用此类抗体可能存在的疗效不足风险。
研究背景
肌肉特异性酪氨酸激酶（MuSK）抗体阳性重症肌无力（MG）是一种罕见的自身免疫性疾病，由靶向MuSK的自身抗体引起。这些抗体主要通过干扰乙酰胆碱受体（AChR）的簇集来阻断神经肌肉信号传递。其临床特征为疲劳性肌无力，尤其影响延髓肌、肢体和呼吸系统，导致较高的肌无力危象风险，患者常伴有肌肉萎缩。目前的常规治疗包括皮质类固醇和其他免疫抑制剂，虽然能改善部分患者的症状，但往往需要长期或高剂量用药，带来剂量依赖性和累积性的不良反应，且部分患者仍表现为治疗依赖或难治性。因此，亟需开发一种能够特异性针对致病机制的新型疗法，以减少长期使用类固醇或免疫抑制剂的潜在副作用，并实现对严重肌无力症状的终身控制。
在生理条件下，MuSK通过与低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4）形成四聚体复合物而被激活。运动神经元分泌的集聚蛋白（agrin）与LRP4结合，促进集聚蛋白/LRP4/MuSK信号复合物的形成，从而激活MuSK下游信号，诱导AChR簇集。在MuSK-MG中，致病性自身抗体主要识别MuSK的免疫球蛋白样1（Ig1）结构域，通过抑制LRP4-MuSK相互作用干扰四聚体复合物的形成，降低MuSK磷酸化，损害下游信号通路，最终导致神经肌肉传递障碍。因此，突触后LRP4-MuSK信号受损被认为是MuSK-MG的关键致病因素。此外，突触后功能障碍也可能参与脊髓性肌萎缩症、肌萎缩侧索硬化症（ALS）等疾病的发病机制。
抗体介导的信号激活是激活MuSK通路的另一种治疗策略。已有报道称，抗MuSK激动性抗体可逆转DOK-7缺陷型和集聚蛋白缺陷型先天性肌无力综合征（CMS）小鼠模型以及被动转移MuSK-MG模型中的肌肉缺陷。然而，将MuSK激活抗体应用于临床实践，需要了解MuSK-MG患者自身抗体的数量和特性如何影响其疗效。基于此，研究人员生成了抗MuSK激动性抗体，并评估其在致病性自身抗体存在下恢复MuSK信号的能力，特别是在MuSK-MG小鼠模型和表达人源MuSK的肌管模型中检验其疗效。
主要技术方法
- 1.
动物模型建立：采用人类MuSK Ig1结构域肽段主动免疫雌性C57BL/6和A/J小鼠，建立MuSK-MG小鼠模型。
- 2.
抗体开发：从MuSK免疫的大鼠中筛选杂交瘤，获得靶向MuSK Fz结构域的大鼠单克隆抗体，并通过CDR移植进行人源化改造，获得Ab#03-H和Ab#40-H两个候选抗体。
- 3.
体外功能评价：利用C2C12和HSMM肌管细胞进行AChR簇集实验，通过免疫印迹检测MuSK酪氨酸磷酸化水平。
- 4.
体内神经肌肉功能评估：通过肌电图（EMG）记录复合肌肉动作电位（CMAP）的递减率，以及通过悬挂实验评估小鼠肌力。
- 5.
组织学分析：使用α-银环蛇毒素和抗突触素-1抗体对离体比目鱼肌进行全组织免疫荧光染色，定量分析神经肌肉接头（NMJ）结构。
- 6.
患者血清研究：收集12例日本MuSK-MG患者的血清样本，通过细胞ELISA进行表位作图，并在表达人源MuSK的小鼠肌管模型中评估患者自身抗体对激动性抗体疗效的影响。
研究结果
1. 新型抗MuSK激动性抗体的开发
研究人员通过筛选获得了两种人源化抗MuSK激动性抗体Ab#03-H和Ab#40-H。这两种抗体均能以不依赖集聚蛋白的方式诱导人和小鼠MuSK信号激活，促进AChR簇集。表面等离子共振（SPR）分析显示，Ab#03-H对人MuSK和小鼠MuSK具有极高的亲和力（KD分别为0.22 nM和0.78 nM），而Ab#40-H的亲和力略低（分别为13.8 nM和16.9 nM）。
2. Ab#40-H通过结合Fz结构域完全激活MuSK信号
通过细胞ELISA进行结构域定位，研究人员发现Ab#40-H结合MuSK的Fz结构域，而非Ig1结构域。在C2C12肌管中，Ab#40-H诱导的AChR簇集呈现钟形剂量反应曲线，其最大效应与集聚蛋白相当，表明其作为MuSK信号激动剂的强大潜力。
3. MuSK信号刺激恢复MuSK-MG小鼠的肌无力症状
在MuSK Ig1肽段免疫建立的MuSK-MG小鼠模型中，Ab#03-H（10和30 mg/kg，每周两次）显著抑制了进行性肌无力，维持了肌肉功能。肌电图分析显示，虽然未达到统计学显著性，但Ab#03-H治疗组小鼠的CMAP递减率有所改善。这表明MuSK激动性抗体通过恢复被自身抗体抑制的MuSK信号，显示出预防肌无力进展的治疗潜力。
4. MuSK激活维持NMJ结构
在A/J小鼠的MuSK-MG模型中，免疫组化分析显示，疾病模型小鼠NMJ处的AChR簇集强度显著降低，神经末梢呈点状结构。而接受30 mg/kg Ab#03-H治疗的小鼠，其比目鱼肌中AChR簇集的平均强度显著高于对照组，几乎与非免疫小鼠的水平一致。这证实了MuSK激动性抗体通过维持NMJ结构来防止肌无力进展。
5. Ab#40-H在1% MuSK-MG血清存在下增强AChR簇集
在表达人源MuSK的C2C12肌管模型中，12份MuSK-MG患者血清中有5份在1%浓度下显著抑制了集聚蛋白诱导的AChR簇集。然而，加入Ab#40-H后，即使在存在这些抑制性血清的情况下，也能显著增强AChR簇集的形成，信号水平与集聚蛋白诱导的相当。这些血清来自不同疾病严重程度和类固醇反应状态的患者，提示MuSK激动性抗体可能在大多数MuSK-MG患者中有效。
6. Ab#40-H在自身抗体存在下激活MuSK信号
使用纯化的患者IgG进行实验发现，高浓度（相当于10%血清IgG）的患者自身抗体可剂量依赖性地降低Ab#40-H诱导AChR簇集的效果。竞争性结合实验表明，患者自身抗体与Ab#40-H之间不存在直接的竞争性抑制，提示疗效降低可能并非由于表位竞争，而是由其他非竞争性机制介导。
总结与讨论
本研究证实了MuSK激动性抗体在主动免疫MuSK-MG小鼠模型以及含有人MuSK-MG患者自身抗体的人源化肌管模型中的疗效。研究人员开发的Ab#40-H和Ab#03-H抗体通过结合MuSK的Fz结构域，实现了对MuSK信号通路的完全激活。研究结果支持将MuSK激动性抗体作为一种有前景的MuSK-MG治疗策略。
然而，研究也指出，高浓度的患者自身抗体可能会削弱激动性抗体的疗效。由于患者自身抗体与激动性抗体并不直接竞争结合MuSK，这种抑制作用可能源于某些特定类型的自身抗体（如IgG1-3亚类）通过非经典途径干扰AChR簇集。因此，未来的临床应用需要考虑患者分层，即根据自身抗体的水平和类型筛选出可能反应良好的患者。对于疗效不佳者，可能需要联合使用降低自身抗体水平的疗法（如利妥昔单抗或efgartigimod），以实现最小临床表现状态并减少免疫抑制剂的用量。
研究结论：本研究的实验结果为了解MuSK激动性抗体作为MuSK-MG新型疗法的应用提供了宝贵见解。研究结果表明，MuSK激动性抗体的疗效易受患者自身抗体谱（包括血药水平和类型）变化的影响。因此，在MuSK-MG患者中选择良好应答者，并考虑辅助疗法以尽量减少免疫抑制剂的使用，是未来有效临床使用MuSK激动性抗体的有前景的策略。此外，MuSK信号激活疗法也可能适用于其他因MuSK信号减弱导致的NMJ功能障碍疾病，如CMS和年龄相关性肌少症。
