《NeuroToxicology》：Chronic manganese exposure disrupts dopamine biosynthesis and amphetamine response in a mouse model of altered dopamine transport
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多巴胺（dopamine）是一种单胺类神经递质，在发育期及成年期大脑中调控运动技能、学习与奖赏通路等多种功能。多巴胺转运体（dopamine transporter, DAT）通过清除突触间隙的多巴胺来调节其信号强度与可利用性，因此多巴胺转运的紊乱会直接影响包
多巴胺（dopamine）是一种单胺类神经递质，在发育期及成年期大脑中调控运动技能、学习与奖赏通路等多种功能。多巴胺转运体（dopamine transporter, DAT）通过清除突触间隙的多巴胺来调节其信号强度与可利用性，因此多巴胺转运的紊乱会直接影响包括运动过度、精细运动缺陷、重复行为及社交缺陷在内的行为结局。多巴胺稳态（包括清除、回收与释放）的失调可见于多种神经精神疾病及智力发育障碍（Intellectual and Developmental Disabilities, IDDs），如注意缺陷多动障碍（Attention Deficit Hyperactivity Disorder, ADHD）和自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）。锰（Manganese, Mn）是多种脑功能所必需的微量营养素，但慢性过量累积可导致锰中毒（manganism），其临床表现类似帕金森病（Parkinson’s Disease）。即使在假定安全或无毒性的暴露水平下，锰暴露也与儿童及青少年的神经发育结局相关。性别在锰暴露敏感性及中枢神经系统兴奋剂反应中均可能发挥调节作用。本研究旨在探究中度慢性锰过量暴露是否影响与IDD相关的行为结局及药理学干预反应，并检验这些效应是否存在性别差异。研究人员使用携带DAT T356M杂合突变（DATT356M/+）的小鼠模型，该模型表现出轻微的多动表型及其他轻度行为损害，适合用于检测环境因素的修饰作用。小鼠自约6周龄起分别接受含70 ppm（对照）或2400 ppm（高锰）的饮食处理，持续12周。行为测试包括自发活动、自发重复行为、转棒实验及苯丙胺（amphetamine）攻击实验。结果显示，高锰饮食使大脑皮层锰含量约升高2倍，且不受性别或基因型影响。锰暴露在雄性小鼠中于饮食处理4周时增加攀爬行为并减少理毛行为，但该效应在12周时消失；雌性DATT356M/+小鼠在12周时表现出更多的攀爬和站立行为。苯丙胺反应呈现显著的性别依赖性差异：雄性DATT356M/+小鼠对苯丙胺的反应几乎完全消失，而雌性突变小鼠仅表现为部分减弱；此外，锰暴露仅在雌性小鼠中显著降低苯丙胺的促活动效应，且不受基因型影响。在分子水平上，高锰饮食显著增加了核团中多巴胺转运体基因（Slc6a3）的表达，且雌性高于雄性；锰暴露和DATT356M/+基因型均显著降低α-突触核蛋白基因（Snca）的表达。锰暴露还增加了酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）基因表达，并降低去甲肾上腺素（norepinephrine）水平、升高血清素（serotonin, 5-HT）水平。此外，锰暴露在DATT356M/+小鼠中增加了儿茶酚-O-甲基转移酶（catechol-O-methyltransferase, COMT）基因表达，并降低了单胺氧化酶A（monoamine oxidase A, MAO-A）基因表达。这些结果表明，亚毒性水平的慢性锰暴露可通过性别依赖性方式影响多巴胺的合成、转运与代谢，并显著改变对苯丙胺的药理学反应，提示基因-环境交互作用可能对携带特定遗传变异的个体产生更为深远的影响，尤其在女性中更为显著。
论文解读
一、研究背景与问题
多巴胺（dopamine）是大脑中一种关键的单胺类神经递质，调控运动功能、学习记忆、奖赏通路及动机行为等多种生理过程。多巴胺转运体（dopamine transporter, DAT）通过将突触间隙的多巴胺重新摄取回突触前神经元，精确调控突触多巴胺的浓度与信号持续时间。DAT功能异常可直接导致行为异常，包括运动过度、重复刻板行为、精细运动缺陷及社交障碍等，这些表型常见于注意缺陷多动障碍（ADHD）和自闭症谱系障碍（ASD）等智力发育障碍（IDDs）患者。大量遗传学研究已发现DAT及多巴胺受体DRD2等基因的单核苷酸多态性（SNPs）与IDD风险相关，且性别被认为是重要的修饰因素。
锰（Mn）是人体必需的微量元素，作为多种酶的辅因子参与包括多巴胺合成与调控在内的多种脑功能。然而，慢性过量锰暴露可导致锰中毒，其临床表现与帕金森病相似。更重要的是，即使在通常认为安全或无毒性的暴露水平下，锰暴露也与儿童和青少年的神经发育不良结局相关，涉及多个国家和地区的流行病学研究均报告了此类关联。已有研究表明，锰可影响人类及啮齿类动物中DAT的结合潜力，但效应方向因暴露剂量（神经毒性水平vs亚毒性水平）而异。此外，锰的职业暴露（如焊接）在男性中更为普遍，造成文献中的性别偏倚；而动物研究提示雌雄个体对锰的敏感性存在差异。ADHD患者可能对锰暴露更为易感，提示存在基因-环境交互作用。然而，亚毒性水平的慢性锰暴露是否会影响与IDD相关的行为表型及药物反应，以及这些效应是否存在性别差异，尚缺乏系统研究。
二、研究目的与实验设计
本研究旨在探讨中度慢性锰过量暴露对野生型小鼠及多巴胺转运异常小鼠模型的行为表型和药理学反应的影响，检验基因-环境交互作用的存在及其性别依赖性。研究人员选用携带DAT T356M杂合突变（DATT356M/+）的小鼠模型，该突变源自一名同时患有自闭症和ADHD的男性患者，其功能表现为多巴胺摄取受损和果蝇模型中的活动过度。杂合小鼠表现出轻微的多动表型和其他轻度行为损害，适合用于检测环境因素的修饰效应。小鼠自约6周龄起随机分配至含70 ppm（对照）或2400 ppm（高锰）的饮食处理，持续12周，每组包含8–13只小鼠，涵盖两种性别、两种基因型和两种饮食处理。
三、主要技术方法
研究人员采用了多种行为学和分子生物学技术。行为学评估包括：自发活动测试（使用MedAssociates活动箱记录红外光束阻断次数以量化运动距离和站立次数）、自发重复行为录像分析（在透明圆柱容器中记录15分钟攀爬、站立、理毛和挖掘行为）、转棒实验（rotarod，评估运动协调与学习能力）以及苯丙胺攻击实验（腹腔注射3 mg/kg苯丙胺后监测2小时活动变化）。分子生物学方法包括：实时定量PCR（qPCR）检测核团（nucleus accumbens）中金属转运体（DMT1、ZIP8、ZIP14、ZnT10）及多巴胺代谢通路相关基因（DAT、TH、VMAT2、MAO-A、COMT、SNCA等）的表达；Western blot检测尾壳核（caudate putamen）中酪氨酸羟化酶（TH）及其磷酸化形式（pTH）和DAT蛋白水平；高效液相色谱（HPLC）检测皮层单胺类神经递质水平；电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）检测皮层锰和铁含量。
四、研究结果
4.1 小鼠体重：所有组别小鼠体重随实验进程正常增长，高锰饮食未影响生长曲线，表明2400 ppm锰浓度不产生明显全身毒性。
4.2 基线自发活动：DATT356M/+小鼠在基线30分钟活动测试中较野生型小鼠探索距离增加约35%，此表型在雌雄两性中均得到重复验证。站立行为（rearing）的增加仅在雌性突变小鼠中达到统计学显著。所有组别均表现出正常的习惯化过程。
4.3 自发重复行为：在饮食处理4周后，雄性DATT356M/+小鼠表现出更多攀爬行为，高锰饮食进一步增加了两种基因型雄性小鼠的攀爬行为并减少了理毛行为；但在饮食处理12周后，雄性小鼠中这些差异消失。雌性DATT356M/+小鼠在4周时攀爬行为增加，在12周时攀爬和站立行为均高于野生型，但饮食处理未进一步影响雌性行为。
4.4 转棒实验：雄性小鼠在各组间表现无差异。雌性DATT356M/+小鼠在转棒上停留时间显著长于野生型小鼠，表现出更好的运动协调能力，锰饮食无额外效应。
4.5 苯丙胺反应：雄性DATT356M/+小鼠对苯丙胺诱导的活动增强反应几乎完全消失，锰饮食未进一步改变此效应。雌性DATT356M/+小鼠对苯丙胺的反应仅部分减弱；此外，高锰饮食在雌性小鼠中（两种基因型均如此）显著降低了苯丙胺的活动增强效应，而雄性中未见此效应。
4.6 生化分析：高锰饮食使皮层锰含量约升高2倍，铁含量不受影响，证实效应为锰特异性。金属转运体基因表达方面，DMT1（Slc11a2）基因表达在高锰饮食下增加，且在雌性DATT356M/+小鼠中增幅最大；ZIP8（Slc39a8）和ZIP14（Slc39a14）表达在雌性中较高，且锰与基因型的交互作用显著；ZnT10（Slc30a10）表达不受影响。单胺水平方面，皮层多巴胺及其代谢物DOPAC和HVA在各组间无差异；锰饮食显著降低去甲肾上腺素水平并升高血清素（5-HT）水平。基因表达方面，锰饮食增加酪氨酸羟化酶（TH）基因表达，但总TH蛋白及磷酸化TH蛋白仅呈边缘性升高（P=0.07）；雌性小鼠的pTH/TH比值显著低于雄性。VMAT2（Slc18a2）基因表达仅在雄性高锰饮食组中增加。MAO-A（Mao-a）表达被DAT基因型和锰饮食共同下调；COMT（Comt）表达在DATT356M/+小鼠中因锰饮食而显著增加，尤其在雄性中最为明显。DAT基因（Slc6a3）表达在核团中显著增加，受锰饮食、DAT基因型和性别三重影响（雌性高于雄性），但尾壳核中DAT总蛋白水平无显著差异。α-突触核蛋白基因（Snca）表达被锰饮食和DAT基因型显著下调，且两者存在交互作用。
五、讨论与结论
本研究表明，亚毒性水平的慢性锰暴露（使脑锰含量约升高2倍）虽未引起明显的全身毒性或运动功能障碍，但足以产生功能性神经毒性效应，表现为行为改变和对药理学挑战反应的显著变化。锰暴露对自发行为的影响较为轻微且具有时间依赖性（雄性小鼠在4周时的行为改变在12周时消失），提示可能存在稳态适应机制。更为重要的发现是苯丙胺反应的性别依赖性差异：雄性DATT356M/+小鼠对苯丙胺几乎完全无反应，而雌性突变小鼠仅部分减弱；锰暴露仅在雌性中进一步削弱苯丙胺的效应。这一结果与雌性中更高的DAT基因表达水平相吻合，提示锰可能通过上调DAT表达加速多巴胺清除，从而减弱苯丙胺的作用。SNCA（编码α-突触核蛋白）的显著下调可能影响DAT在膜上的稳定性与功能，进一步解释锰暴露后多巴胺清除加速的现象。COMT表达增加和MAO-A表达降低则反映了多巴胺代谢通路的适应性调整。这些发现共同提示，基因-环境-性别三者之间存在复杂的交互作用，慢性低水平锰暴露可能对携带特定遗传变异的个体（尤其是女性）产生更为显著的影响，不仅改变疾病相关表型的基线表达，还可能显著改变药理学干预的反应性。该研究为理解环境暴露如何与遗传易感性交互影响神经发育障碍的临床表现和药物治疗效果提供了重要证据，强调了在评估环境毒物健康风险时需考虑性别和遗传背景的个体差异。
