《New Biotechnology》：Microalgae Path to Premium Vegetable Oil: Fermentation strategy to produce
Auxenochlorella protothecoides single cell oil analogue to olive oil
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摘要专业翻译
微藻能够积累油脂和蛋白质，但其主要储存产物受培养条件影响显著。本研究旨在开发一种可规模化的异养（heterotrophic）发酵策略，用于提高原始小球藻（Auxenochlorella protothecoides，AP）的生物量浓度和油脂含量，
摘要专业翻译
微藻能够积累油脂和蛋白质，但其主要储存产物受培养条件影响显著。本研究旨在开发一种可规模化的异养（heterotrophic）发酵策略，用于提高原始小球藻（Auxenochlorella protothecoides，AP）的生物量浓度和油脂含量，同时将其C18脂肪酸谱导向与初榨橄榄油（virgin olive oil）相当的油酸（oleic acid）主导型组成。研究发现，当葡萄糖浓度超过30.0 g L-1时，细胞生长受到抑制。为此，研究人员采用了一种由溶解氧（dissolved oxygen，DO）和pH控制的补料分批（fed-batch）发酵策略，通过维持葡萄糖浓度低于抑制阈值（14–23 g L-1），实现了高细胞密度培养，最终获得80 g L-1的生物量，油脂含量达66.2%。该微藻油富含油酸（72.85%），不饱和脂肪酸含量高达87.3%，与初榨橄榄油相当。此外，葡萄糖补料策略和培养时间显著影响油脂的脂肪酸组成、细胞生长和干细胞重浓度。在2 L至10 L生物反应器规模之间，细胞生长、油脂含量和脂肪酸谱保持一致，证明了该工艺的可扩展性。该研究为以微藻为平台生产与初榨橄榄油脂肪酸谱相似的优质植物油提供了一条潜在的可持续替代路径。
论文解读
一、研究背景与意义
食用油因其来源和加工方式不同而具有不同的脂肪酸组成，这直接影响其营养和功能特性。在众多食用油中，富含高油酸的优质植物油因其明确的单不饱和脂肪酸谱和适宜的氧化稳定性而备受关注，初榨橄榄油便是油酸丰富型脂质谱的广泛参考标准。然而，扩大这类优质植物油的产量受到农业用地需求、气候多变性和不同作物生产系统环境负担的制约。同时，海洋来源油脂也面临鱼类资源压力、生态系统影响和污染风险等问题。这些局限凸显了开发能够提供稳定且营养相关脂肪酸谱的可持续替代油源的必要性。
产油微藻（oleaginous microalgae）作为微生物油脂生产的潜在平台，其培养可减少对耕地的依赖。在适当条件下，多种微藻能积累大量油脂，其脂肪酸谱可包含不同不饱和度的C16和C18脂肪酸，还可含有ω-3和ω-6脂肪酸、生育酚及具有抗氧化活性的色素等营养保健成分。然而，大多数微藻油脂研究集中于生物柴油导向目标，往往优先考虑总油脂积累而非匹配食用优质油的组成。对于食品相关应用而言，要求更为具体，因为必须同时实现油脂生产力和目标脂肪酸分布。
生产具有橄榄油样脂肪酸谱的微藻油脂颇具挑战性，因为微藻油脂通常表现出比油酸丰富型植物油更广泛的组成多样性。脂肪酸分布取决于菌株、代谢状态和培养参数，包括营养供给、培养模式和环境条件。氮或磷等营养限制常与油脂积累增加相关，但也可能增加饱和脂肪酸比例并改变多不饱和脂肪酸水平。尽管可以通过工艺优化调节微藻的脂肪酸组成和油脂积累，但异养培养尚未生产出可与初榨橄榄油等优质植物油相媲美的油脂。因此，本研究旨在开发一种可规模化的异养发酵策略，在提高生物量浓度和油脂含量的同时，将C18脂肪酸谱导向与初榨橄榄油相当的油酸主导型组成。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员开展了系统的发酵工艺研究，从批次发酵（batch fermentation）到补料分批发酵逐步优化，最终在2 L和10 L生物反应器中验证了工艺的可扩展性。研究所用的主要关键技术方法包括：采用改良的Bold's Basal Medium（BBM）培养基，以酵母提取物（yeast extract，YE）替代NaNO3作为氮源；在2 L Biostat? B-DCU生物反应器中进行批次发酵，考察不同初始葡萄糖浓度（10–50 g L-1）对细胞生长的影响，并比较不同C/N比条件下的生长与油脂积累差异；开发DO–pH控制的补料分批发酵策略，通过离线残糖测定调整葡萄糖补料速率，维持葡萄糖浓度在14–23 g L-1的非抑制范围内；在2 L和10 L两种规模下进行放大验证，通过级联控制维持DO在50%；采用高效液相色谱测定葡萄糖浓度，氮分析仪测定总氮，按照AOAC Official Method 996.06将脂肪酸转化为脂肪酸甲酯后，利用配备SP TM-2560毛细管柱和火焰离子化检测器的气相色谱进行脂肪酸组成分析。微藻菌株AP SAG 211-7a购自德国哥廷根大学。
三、研究结果
3.1 批次培养
研究人员首先考察了葡萄糖浓度对AP比生长速率的影响。结果表明，当葡萄糖浓度超过30 g L-1时，比生长速率从0.11 h-1降至0.07 h-1，提示高葡萄糖浓度可能产生底物抑制效应。基于此，研究人员选择30 g L-1葡萄糖和10 g L-1YE（C/N比12:1）作为基线条件，并与含45 g L-1YE（C/N比2.66:1）的富氮培养基进行比较。在低YE条件下，最大干细胞重（DCW）浓度在50 h时达到20.0 ± 1.0 g L-1，随后在67 h时下降至18.1 ± 0.7 g L-1，表明进入死亡期；而在高YE条件下，最大DCW浓度在70 h时达到38.0 g L-1。低YE条件下，指数生长期后生物量由绿色变为黄色，这与氮限制下叶绿素降解有关，此时油脂含量为18.7 ± 0.5%；而高YE条件下生物量保持绿色，油脂含量仅为7.2 ± 0.4%。批次培养所得油脂的脂肪酸谱与初榨橄榄油差异较大，油酸含量相对较低（50.4 ± 0.66%），而亚油酸（26.8 ± 0.43%）和亚麻酸（6.2 ± 0.1%）含量较高。不过，不饱和脂肪酸（82.7%）和饱和脂肪酸（17.3%）的总体比例与初榨橄榄油（分别约81.4%和14.6%）大致相当。
3.2 补料分批培养
为克服批次培养中高葡萄糖抑制生长和油脂含量偏低的问题，研究人员开发了补料分批发酵策略。初始葡萄糖浓度为20 g L-1，在30 h残糖降至约15 g L-1时启动葡萄糖补料（400 g L-1），通过离线测定调整补料速率，将残糖维持在14–23 g L-1范围内。在此策略下，DCW从30 h的7.5 g L-1稳步上升至120 h的53.5 g L-1，并在218 h达到最大值80.0 g L-1。残蛋白从接种时的6.25 g L-1快速降至50 h的约2.0 g L-1，此后保持低水平，表明培养在氮限制条件下进行。补料在190 h终止后，残糖在发酵结束时仅剩1.2 g L-1。油脂含量随培养时间稳步增加，218 h时达到干生物量的66.2%，其中不饱和油脂占干生物量的57.8%，饱和油脂占8.4%，分别占总油脂的87.3%和13.7%。培养过程中C/N比从起始的约8:1逐渐升至190 h的约35:1，为脂质合成创造了有利条件。
脂肪酸组成分析显示，补料分批培养显著改变了脂肪酸谱。油酸从40 h的59.42%增加至119 h的72.85%，成为主要脂肪酸；亚油酸和亚麻酸比例则相应下降。119 h后脂肪酸组成变化较小，表明培养达到相对稳定的脂质谱。190 h时油酸含量达73.9%，亚油酸为12.3%，均落在初榨橄榄油的报道范围内。研究人员还比较了DO设定值30%和50%对生长的影响。两种条件下早期生长相似，但在细胞密度约55 g L-1之后，30% DO培养进入稳定期，而50% DO培养继续生长至80 g L-1，说明高细胞密度下氧供应成为限制因素。
在2 L和10 L生物反应器的放大研究中，两种规模的生长曲线高度一致。10 L反应器在96 h时DCW达43.5 g L-1，212 h后增至76.3 g L-1，平均生物量生产率为0.36 g L-1 h-1。前100 h的生物量生产率约0.50 g L-1 h-1（12.0 g L-1 d-1），约为已有报道值的两倍。10 L反应器在218 h时油脂含量为62.7%，与2 L反应器的66.2%相当；脂肪酸谱也仅有微小差异，油酸在两种规模下分别为71.0%和73.77%，亚麻酸几乎相同（0.93% vs 0.95%）。
四、讨论与结论
该研究表明，通过补料分批高细胞密度异养发酵，可以开发出一条生产橄榄油类似物的微藻途径，作为传统农业的潜在更可持续替代方案。在批次发酵中，高葡萄糖与YE比促进了AP细胞中油脂和黄色色素的积累，但高葡萄糖浓度抑制了细胞生长，使培养在50 h时提前进入稳定期。通过优化补料分批发酵工艺，在DO为50%、pH 6.5、温度25 °C的条件下，控制葡萄糖补料使最大细胞生物量产量达到80.0 g L-1，218 h后油脂含量为66.2%。值得注意的是，发酵时间不仅增加了AP细胞中的油脂含量，还影响了其脂肪酸组成。不饱和和饱和油脂含量随发酵时间增加，分别达到干生物量的57.8%和8.4%，脂肪酸谱与初榨橄榄油相似。油酸是主要脂肪酸（71–73%），总体脂肪酸组成与初榨橄榄油高度接近。所开发的发酵策略为生产脂肪酸谱与初榨橄榄油相似的微藻油提供了一种可规模化的方法。
