《Molecular Ecology Resources》：MitoNumt: A Workflow for Recovering Mitochondrial Genomes From Long-Read Data and Detecting NUMT Contamination in Mitochondrial Genome Assemblies
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核线粒体DNA片段（NUMTs）是来源于线粒体DNA序列历史上插入核基因组后形成的基因组DNA片段。在利用短读长基因组测序数据进行线粒体基因组（mtgenome）组装时，NUMT片段可能被误识别并整合入mtgenome组装结果，从而导致NUMT污染。尽管一些组
核线粒体DNA片段（NUMTs）是来源于线粒体DNA序列历史上插入核基因组后形成的基因组DNA片段。在利用短读长基因组测序数据进行线粒体基因组（mtgenome）组装时，NUMT片段可能被误识别并整合入mtgenome组装结果，从而导致NUMT污染。尽管一些组装程序包含过滤NUMT的步骤，但这些方法并非总是有效。在此，研究人员提出MitoNumt，一种多功能工作流程。利用该流程，研究人员从五个Panthera属物种和Puma concolor的PacBio HiFi长读长测序数据中恢复了mtgenome、完整NUMT（与mtgenome共存）和不完整NUMT片段。随后，研究人员使用这些序列检查了NCBI数据库中可获得的mtgenome。在所检查的所有Panthera物种的mtgenome中均检测到NUMT污染，共鉴定出23个受污染mtgenome，污染长度为3至416 bp。此外，由至少5000 bp的NUMT片段重建的系统发育树一致地恢复了与当前公认的Panthera系统发育关系一致的拓扑结构。总体而言，该工作流程能够鉴定HiFi支持的mtgenome和完整NUMTs，并检测组装mtgenome中的NUMT污染，从而提高基于mtgenome的进化和遗传研究的可靠性。
论文解读：MitoNumt工作流程及其在Panthera和Puma concolor中的应用
研究背景方面，尽管过去十年全基因组测序数据已成为生物学研究的常规数据类型，但线粒体基因组（mtgenome）数据在系统发育、群体遗传和保护遗传研究中仍不可替代。线粒体DNA（mtDNA）具有母系遗传、单倍型结构清晰、进化速率相对较快以及易于从历史或低质量样本中恢复等特点，因此长期广泛用于系统发育、系统地理分析和遗传多样性评估。尤其在野生动物保护研究中，遗传采样常受限，mtDNA仍是评估群体结构、历史人口动态和界定保护管理单元的重要分子信息来源。技术层面，尽管PacBio HiFi和Oxford Nanopore等三代长读长测序技术快速普及，但下一代短读长测序仍是非模式生物和资源有限研究中经济实用的mtgenome组装资源。已有多种基于短读长或混合测序数据的计算策略，包括参考引导、从头组装和bait-and-extend方法，但长期未解决的问题是这些工具无法完全阻止某些核线粒体DNA片段（NUMTs）被组装进mtgenome。NUMTs来源于mtDNA片段在进化历史中转移并插入核基因组，几乎存在于所有真核生物中，并在不同物种间存在长度、拷贝数和序列相似性差异。许多哺乳动物中，一些NUMT与mtDNA序列极度相似，甚至可覆盖完整或近完整mtgenome长度。短读长组装时，这些高度相似序列可能被误认为mtgenome来源，导致假阳性变异、错误单倍型推断以及潜在误导性的系统发育或群体遗传推断。常见识别NUMT策略是检测同时比对到核基因组和mtgenome的测序读长，但该任务受测序错误和读长限制，难以用短读长恢复长NUMT序列。PacBio HiFi等高准确长读长技术提供了解决方案：足够长的HiFi读长可跨越整个mtgenome，并完全覆盖相当长度的NUMT序列，从而重建某物种中完整NUMT集合。然而，目前尚无整合工作流程能够直接从长读长数据重建NUMT序列、将这些序列作为碱基级NUMT污染检测的综合参考，并提供分析完整和部分NUMT插入的灵活性。因此，研究人员提出MitoNumt。
研究人员开展了MitoNumt工作流程研究，用于系统识别基因组尺度NUMT片段。该流程利用PacBio HiFi读长跨越重复区域和区分高度相似序列的高准确性，结合常规过滤和基于比对一致性的过滤策略，从HiFi长读长数据中识别mtgenome序列、完整NUMTs和不完整NUMT片段，并用于检测mtgenome组装中的NUMT来源污染。研究人员将该流程应用于五个Panthera属物种和Puma concolor，并检查NCBI数据库中公开可用的mtgenomes。结论是，在所检查的所有Panthera物种mtgenomes中检测到NUMT污染，共23个污染mtgenomes，污染长度为3至416 bp；由至少5000 bp的NUMT片段重建的系统发育树一致恢复与当前公认Panthera系统发育关系一致的拓扑结构。该研究意义在于，MitoNumt能够鉴定HiFi支持的mtgenomes和完整NUMTs，检测组装mtgenomes中的NUMT污染，从而提高基于mtgenome的进化和遗传研究可靠性，并可为进化和基因组结构分析提供NUMT序列资源。
关键技术方法方面，样本队列来源为NCBI下载的五个Panthera物种（Panthera leo、Panthera tigris、Panthera onca、Panthera uncia、Panthera pardus）和Puma concolor的基因组、mtgenomes及PacBio HiFi测序数据集。研究人员用minimap2将HiFi长读长比对到参考mtgenome，并在Integrative Genomics Viewer（IGV）中人工筛选跨mtgenome长读长以重建HiFi支持mtgenome；将HiFi mtgenome比对到同物种长读长参考基因组，保留大于150 bp的比对区域，采用延伸策略（上下游各延伸2 kb）或非延伸策略构建NUMT参考序列；比对HiFi读长后，延伸策略在IGV中筛选跨基因组区和NUMT区的长读长，非延伸策略提取比对一致性大于98%的读长；用MAFFT进行多序列比对，以80%一致阈值重建NUMT一致序列，并过滤少于10个变异位点和分歧率低于1%的序列及重复序列；用numt_base_from_msa.py检测污染，并进行人工校正；用PhyloSuite进行贝叶斯系统发育分析，采用1000至13000 bp滑动窗口、步长50 bp，共650个窗口。
研究结果如下。3.1 Workflow Overview（工作流程概述）显示，MitoNumt包含四个主要步骤：从HiFi读长恢复HiFi支持mtgenome；识别候选NUMT参考序列；选择对应候选NUMT区域的长读长；重建NUMT序列。通过该流程设计，研究人员建立了从长读长数据恢复mtgenome和NUMT序列的框架。
3.2 Detection of NUMT Sequences in Panthera and Puma concolor（Panthera和Puma concolor中NUMT序列检测）中，研究人员使用MitoNumt重建了五个Panthera物种和P. concolor的mtgenomes。对每个Panthera物种，鉴定出1个完整NUMT（16,494–16,783 bp）和多个不完整NUMT序列（170–4415 bp）。雪豹、狮和虎中含有完整NUMT参考序列的染色体与美洲豹中的相应染色体不同源。P. concolor最长NUMT为15,961 bp，由来自不同染色体的五个NUMT片段经修剪和拼接重建。鉴定的NUMT序列数量分别为：虎26、雪豹27、豹28、狮25、美洲豹27、美洲狮29。
3.3 Detection of NUMT Contamination in Publicly Available Mtgenomes（公开可用mtgenomes中NUMT污染检测）中，研究人员使用上述鉴定NUMT序列和HiFi支持mtgenomes，筛选NCBI数据库中Panthera物种和P. concolor的mtgenome数据。结果共23个mtgenome被鉴定含NUMT来源污染，分别为虎53/4、雪豹157/3、豹49/5、狮42/3、美洲豹18/8、美洲狮25/0（总数/污染数）。除4个mtgenome同时受完整NUMT和对应物种NUMT片段污染外，其余mtgenome中的污染位点仅来自完整NUMTs。污染碱基数范围为3至416 bp。进一步检查组装流程发现，MitoNumt在2个使用NOVOPlasty组装的mtgenomes和2个使用Geneious组装的mtgenomes中检出NUMT污染；在13个使用NuMtParser和MIA双映射策略组装的美洲豹线粒体基因组中，仍有5个含可检测NUMT污染。由此得出，现有组装策略不能完全消除NUMT污染。
3.4 Phylogenetic Relationships Within the Genus Panthera（Panthera属内系统发育关系）中，由完整NUMT序列和mtgenomes重建的贝叶斯系统发育树拓扑不一致。基于NUMT的Panthera系统发育中，虎和雪豹形成姐妹群并首先分化，而美洲豹、豹和狮聚在一起；基于mtgenome的系统发育中，虎首先分化，其次为美洲豹，然后为雪豹。两种系统发育树的一致特征是狮和豹形成姐妹支。对650个NUMT序列、13种窗口长度的系统发育分析表明，当窗口大小超过5000 bp时，95%推断树与全长NUMT拓扑一致，后验概率大于0.95。Pearson相关分析显示，窗口长度与后验概率正相关（p<0.001，r=0.514），单变量线性回归中窗口长度解释后验概率变异的26.37%（R
2=0.2637）；NUMT位点数与后验概率正相关（p<0.001，r=0.506），解释25.64%的变异（R
2=0.2564）；多变量线性回归模型显示，包含窗口长度和NUMT位点数交互项的模型对数据总体拟合最佳（p<0.001，coefficient=?1.057×10
?7，R
2=0.4248）。限制在小于5000 bp窗口的分析得到一致结果。
讨论部分指出，随着基因组测序技术和计算方法快速发展，研究人员如今可容易地从几乎任何样本的测序数据组装mtgenome，但很少直接获得完整mtgenome序列，组装mtgenome序列的准确性难以独立验证。基于短读长数据的组装极易引入NUMT序列，目前尚无广泛采用的方法精确识别mtgenome中的NUMT污染。该研究结果证明，NCBI数据库中一些mtgenomes确实受NUMT污染影响，并将影响下游分析。因此，鉴定HiFi支持的mtgenomes和NUMT序列是mtgenome分析中的必要步骤，尤其在已知存在NUMT的类群中。
MitoNumt是一种用于NUMT检测和mtgenome验证的多功能工作流程。利用该流程，可直接从PacBio HiFi测序数据恢复mtgenome，鉴定基因组中很大比例的NUMT序列，并筛查组装mtgenome中的NUMT污染。该流程还可报告污染碱基数量和基因组位置，使研究人员能够校正污染位点，并获得用于下游分析的HiFi支持mtgenome。其优势在于提供两种互补策略：推荐使用延伸策略鉴定完整或近完整NUMT序列，使用非延伸策略快速检测不完整NUMT片段。以往多数研究将基因组中NUMT序列作为完整单元分析，报道了许多超级NUMT；但这种超长NUMT对检测线粒体序列中的NUMT污染效用有限。因此，研究人员将这些超级NUMT片段化，并以线粒体基因组长度作为参考，生成不同长度的NUMT片段。因此，其性能在很大程度上独立于核基因组组装水平，本研究成功应用于scaffold级参考基因组也支持这一点。局限是跨越scaffold或contig边界的NUMT会被检测为独立片段而非连续插入，但这不影响下游污染检测，因为每个片段独立评估。
基于当前公共数据库并以线粒体长度作为基准，猫科中已报道最长NUMT约为虎的12.5 kb，其次是家猫的7.9 kb。相比之下，本研究首次在五个Panthera物种中鉴定出与完整线粒体基因组长度相当的完整NUMTs。这提示完整mtgenomes可插入核染色体，且此类事件可能比先前认识更广泛。完整NUMTs最可能造成线粒体污染，但较短NUMT片段也不应忽视；此外，单一线粒体序列可能同时受多个NUMT片段影响。因此，全面检测NUMT污染应整合所有可用NUMT序列，而非仅依赖一个子集。研究结果还表明，一些现有线粒体组装流程不能完全消除NUMT污染；使用NOVOPlasty、Geneious以及结合NuMT Parser和MIA的双映射工作流程组装的mtgenomes中均鉴定到NUMT污染。值得注意的是，后者专为在mtgenome组装前减少NUMT干扰而设计，但若干组装mtgenomes中仍检测到残留NUMT来源序列。这些观察提示，当前组装策略不能完全消除NUMT污染。
除双映射外，另有两类主要NUMT检测策略：基于基因组组装的方法和基于读长的方法。基于基因组组装的框架通过将线粒体基因组比对到核基因组组装来识别NUMT插入，与MitoNumt类似依赖线粒体与核基因组间序列相似性，但其主要设计用于检测核组装中的连续插入。相比之下，MitoNumt将NUMT区域片段化为较小片段，以评估其对mtgenome污染的潜在贡献。基于读长的方法利用不一致双端读长和split-read映射特征直接从测序数据识别新NUMT插入事件，从而表征核基因组内NUMT插入，而非检测组装mtgenome中残留NUMT污染。MitoNumt并非替代现有组装方法，而是提供组装后验证策略，能够识别和定位残留NUMT来源序列，使无论使用何种组装流程的mtgenomes都可被系统评估，从而提高下游系统发育、进化和群体遗传分析可靠性。
由NUMT序列重建的系统发育树可能反映物种间真实进化关系。在Panthera属内，曾提出若干替代系统发育关系；值得注意的是，由完整NUMT获得的拓扑与最广泛接受的系统发育树一致。一个合理假设是NUMT保留线粒体和核进化信号，因此可提供补充性系统发育信息，与核及线粒体标记结合时可能帮助解决复杂进化历史类群中的关系；但该假设取决于NUMT序列内是否有足够信息位点。在Panthera中，研究人员鉴定出约5000 bp的近似阈值长度，超过该长度后，从全长NUMT几乎任意位置提取的片段均保留足够系统发育信号，可一致恢复公认物种关系。相反，对于短于5000 bp的NUMT，必须考虑多种因素；尤其NUMT长度与NUMT位点数间的交互解释了树支持度方差的最大比例。因此，重建系统发育时应优先选择更长且信息位点更多的NUMT序列。有趣的是，与核基因不同，来自非同源染色体的NUMT序列仍可用于重建一致系统发育关系，这可能因为NUMT起源于线粒体DNA。然而，这也需谨慎，因为插入核基因组后，NUMT成为旁系同源序列，并在不同突变率和选择约束下进化。研究人员强调，本研究中约5000 bp阈值特定于Panthera，不应视为普遍适用。系统发育重建的最佳NUMT长度预计取决于多种生物因素，包括类群分化时间、NUMT插入年龄和谱系特异线粒体替换率。对于近期分化或线粒体进化较慢的谱系，可能需要更长NUMT片段恢复足够系统发育信号，而较深分化或线粒体进化较快的谱系可能较短片段即可。因此建议研究人员在自己的研究体系中经验性评估NUMT长度与系统发育性能的关系，而非跨类群应用固定阈值。
使用HiFi支持mtgenomes构建的Panthera系统发育树与先前研究一致。然而，基于NUMT和基于mtDNA的Panthera系统发育仍存在拓扑不一致，这是核–mtDNA不一致的常见例子。对此现象最广泛接受的解释是，雪豹祖先与狮–豹谱系祖先发生杂交；由于mtDNA母系遗传，这一古老渐渗信号被保留，因此mtDNA系统发育常显示雪豹与狮–豹支最近。尽管MitoNumt为恢复NUMT序列和检测mtgenome中NUMT污染提供了高效框架，但仍存在若干局限。由于缺乏包含已知线粒体和NUMT序列的全面且独立验证的基准数据集，无法确定MitoNumt是否能够检查所有NUMTs以及所有NUMT来源污染位点。在真实基因组中，mtgenome和NUMT序列可能存在多态性，而当前工作流程从不同长读长生成一致序列，并未明确表示此类变异。因此，多态NUMT来源位点可能在自动污染检测中被遗漏，并需要人工校正。 consequently，该流程可能无法完全捕获NUMT来源位点处实际线粒体核苷酸状态。未来发展中，研究人员计划通过应用泛基因组方法，将该框架扩展至Pan-NUMT和Pan-MT概念。通过将多个mtDNA和NUMT序列整合到图基参考中，未来改进应能检测更大比例的NUMT来源污染，同时更准确表示候选NUMT来源位点处的线粒体核苷酸状态。
研究结论：总体而言，该工作流程能够鉴定HiFi支持的mtgenome和完整NUMTs，并检测组装mtgenome中的NUMT污染，从而提高基于mtgenome的进化和遗传研究的可靠性。
