《Plant Direct》：Circadian Oscillations in Branchlet Angle and Irradiance-Dependent Acclimation in Chara braunii Under Continuous Light
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摘要
内源性生物节律是陆生植物时间组织化的核心，但其在链型藻类（streptophyte algae）中的演化起源仍未明确。本研究探讨了布劳尼轮藻（Chara braunii）的节律性形态-生理过程是否与内源性调控一致，以及连续光照强度如何调节这些响应。研究人
摘要
内源性生物节律是陆生植物时间组织化的核心，但其在链型藻类（streptophyte algae）中的演化起源仍未明确。本研究探讨了布劳尼轮藻（Chara braunii）的节律性形态-生理过程是否与内源性调控一致，以及连续光照强度如何调节这些响应。研究人员在连续低光（dim light）和连续常规光（regular light）条件下，对C. braunii进行了延时成像、色素定量、叶绿素荧光测量及代谢组学分析。枝轮角度（branchlet angle）的昼夜节律振荡在连续弱光下持续存在，但在连续常规光下被减弱，而节间伸长仅表现出有限的时间结构。在两种不同连续光照条件下每日一次测得的色素和代谢物数据揭示了光强依赖的生理调整，包括叶绿素和类胡萝卜素含量的变化，以及三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环中间产物如苹果酸（malate）和延胡索酸（fumarate）积累模式的改变。叶绿素荧光参数在所采用的采样方案下未检测到可观察的时间变异。比较基因组分析鉴定出多个典型陆生植物时钟相关组件的推定同源基因，而未检测到典型的TOC1和ZTL直系同源基因。综上，这些结果与C. braunii中存在调控节律性输出的内源性调控组件相一致，同时强调光强是能够抑制这些输出的主要调节因子。在较高光强下节律性输出的平行减弱以及向胁迫相关代谢谱的转变表明，较高光强同时影响内源性调控输出和生理驯化响应，但这两个过程是否存在因果关联仍有待确定。
论文解读：布劳尼轮藻枝轮角度昼夜节律振荡及连续光照下光强依赖性驯化研究
一、研究背景与科学问题
内源性生物节律（即昼夜节律钟）是生物体在恒定环境条件下仍能维持约24小时周期生理波动的核心调控机制，其最早由Bünning于1936年正式提出。在陆生植物中，昼夜节律广泛调控器官运动、生长和 stomatal 行为等生理过程，帮助生物体协调细胞活动与可预测的环境变化。然而，这一内源时钟调控系统在演化上何时出现、如何从水生藻类祖先过渡到陆生植物，仍是未解之谜。链型藻类（streptophyte algae）处于陆生植物基部附近的系统发育关键位置，为研究早期链型植物调控提供了独特的演化窗口。布劳尼轮藻（Chara braunii）作为轮藻科代表物种，其基因组已完整测序，但关于其是否具备功能性昼夜节律调控组件的研究仍十分匮乏。此前研究虽观察到轮藻类枝轮运动具有节律性，但无法区分该节律是源于内源自持振荡器还是对光强的直接响应。此外，连续光照对轮藻的光生理和代谢适应的影响也缺乏系统研究。基于此，研究人员提出两个假设：（i）C. braunii的枝轮角度振荡由内源机制协调，在连续光照下持续存在，但在较高光强下减弱；（ii）不同强度的连续光照诱导不同的色素和代谢物驯化响应，并与枝轮角度振荡持续性的差异共发生。
二、主要技术方法
研究人员从NIES保藏中心获取C. braunii NIES-1604品系单藻培养物，经孢子萌发建立半无菌培养体系。实验采用自建LED成像箱进行延时成像，记录枝轮角度动态；使用脉冲振幅调制（pulsed-amplitude modulation, PAM）叶绿素荧光仪（DUAL-PAM-100）测定光合参数并构建光合-光强（PI）曲线；通过分光光度法测定叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）和类胡萝卜素（Car）含量；利用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）系统定量分析35种初级代谢相关代谢物；通过BLAST搜索和系统发育分析鉴定C. braunii基因组中陆生植物时钟相关基因的同源序列。节律性检测采用JTK_CYCLE算法，统计分析在R环境中完成。
三、主要研究结果
3.1 光暗周期下枝轮角度的节律性振荡
在14小时光照/10小时黑暗的光周期条件下，研究人员通过72小时延时成像观察到C. braunii顶端枝轮呈现可重复的昼夜节律性开合运动。枝轮在早晨光开启后保持近垂直位置，随后展开至130°–180°，傍晚临近黑暗期前恢复至90°–110°的垂直方向。JTK_CYCLE分析检测到显著的节律性（p = 0.007），8个独立生物学重复经BH校正后均保持显著。相比之下，节间细胞在昼夜间的相对生长速率无显著差异，表明节间伸长在该光周期下不受昼夜节律调控。
3.2 连续光照下枝轮角度振荡的光强依赖性调节
为检验枝轮运动是否在缺乏外部暗期时仍能持续，研究人员将C. braunii转移至连续常规光（continuous regular light, CRL，30 μmol photons m?2 s?1）和连续弱光（continuous dim light, CDL，15 μmol photons m?2 s?1）条件下。在CRL下，枝轮在转移后最初24小时出现闭合运动，随后部分重新展开但稳定在半开放状态，JTK_CYCLE未检测到显著节律性（p = 0.084）。在CDL下，枝轮在整个60小时记录期间维持显著的周期性开合运动（p = 0.00005），但8个重复中仅6个经FDR校正后保持显著。节间伸长在CRL下无显著昼夜差异，而在CDL下第一个主观夜间伸长率最高。这些结果表明枝轮角度振荡可在CDL下持续，但在较高连续光强下被强烈减弱，与内源性调控组件存在且其输出受光强调节的观点一致。
3.3 连续光照改变C. braunii的色素积累**
在转移至连续光照后12小时（T12）、36小时（T36）和60小时（T60）三个时间点测定色素含量。仅在T12时，CDL处理组的Chl a/Chl b比值显著高于CRL组，而绝对色素浓度无差异。T36时，CDL组的Chl a、Chl b和Car浓度均显著高于CRL组。T60时，色素水平略有下降，仅Chl a/Chl b比值在CDL下仍显著较高。这些结果表明连续光照下色素库呈现光强和暴露时长依赖的动态调整，CDL下色素积累增强反映了低光驯化以提升光捕获能力。
3.4 连续光照下代谢物积累因光强而异
研究人员检测到35种与初级代谢相关的代谢物。在CDL下，多种碳氮代谢相关代谢物在T36和T60时相对T12显著升高；在CRL下，变化幅度较小且变异较大。按化合物类别分组分析显示，CDL下氨基酸和有机酸组间无显著差异，而CRL下氨基酸在T36和T60时的归一化水平显著高于有机酸。这表明连续光照诱导处理特异性的初级代谢库变化，与光强依赖的代谢调整一致。
3.5 特定代谢物在连续弱光和常规光下呈处理依赖性变化
在CDL下，苹果酸、延胡索酸、烟酸和谷氨酸在T36时相对T12显著升高，腺苷和组氨酸显著降低；T60时苹果酸、延胡索酸和烟酸仍显著升高，丙氨酸也显著增加。在CRL下，丝氨酸、苯丙氨酸和α-氨基丁酸在T36时显著升高，α-氨基丁酸在T60时仍保持升高，而丙酮酸在T60时显著降低。这些模式表明不同光强下特定代谢物呈现处理特异性变化，CDL下TCA循环中间产物积累增强，而CRL下出现光呼吸增强和应激代谢特征。
3.6 C. braunii中存在陆生植物时钟相关基因的同源序列
比较基因组分析发现，C. braunii含有多个主要陆生植物时钟相关基因家族的同源序列，但保守程度与开花植物存在显著差异。REVEILLE（RVE）家族仅有一个含N端MYB/SANT结构域的同源物，但缺乏CCA1/LHY的特征性整体结构域架构。PSEUDO RESPONSE REGULATOR（PRR）推定同源物仅保留C端CCT结构域，缺乏典型PRR的N端接收结构域，更适当地描述为CCT结构域蛋白。GIGANTEA（GI）仅在C. braunii和晚分化链型植物类群中高度保守。未鉴定到同时含LOV和Kelch重复结构域的典型ZEITLUPE（ZTL）直系同源物，仅检测到ADAGIO家族成员。相比之下，傍晚复合体（evening complex）组分EARLY FLOWERING 3、4（ELF3和ELF4）和LUX在C. braunii中保守性良好。
四、讨论与结论
研究讨论指出，C. braunii顶端枝轮的节律性运动类似于Darwin描述的感夜运动，夜间闭合可能保护分生组织样顶端免受牧食和附生生物定殖。枝轮角度振荡在CRL下减弱可能反映光强依赖的掩蔽或阻尼效应，而非时钟功能缺失。在较高光强下，光可能更有效穿透叶绿体层，降低枝轮两侧的光可用性对比，导致均匀生长和节律运动消失。光合参数未检测到时间变异，而色素和代谢物呈现光强依赖的驯化响应，表明这些过程可能独立于节律调控。CRL下丝氨酸升高暗示光呼吸增强，苹果酸和延胡索酸水平降低表明TCA循环碳通量改变，整体代谢谱向应激相关方向转变。
研究结论表明，C. braunii表现出在低光强连续光照下持续、较高光强下减弱的枝轮角度昼夜节律振荡，这与内源性调控组件的存在一致。色素含量和代谢物谱反映光强依赖的驯化响应，包括CDL下色素浓度瞬时升高和特定TCA循环中间产物水平增加。多个时钟相关基因家族在C. braunii中的鉴定，尽管相对开花植物保守性不完整，为未来功能实验提供了分子框架，以解析这些组件是否参与观察到的节律性输出及其在较高光强下的减弱机制。
