肠道微生物群在CAR T细胞治疗后驱动内源性T细胞活化

《Cancer Immunology Research》：The Gut Microbiome Drives Endogenous T-cell Activation Following CAR T-cell Therapy

　　

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已成为治疗血液系统恶性肿瘤前景广阔的临床方法，但接受CAR T细胞疗法的患者临床表现仍存在不一致的情况，并伴随肿瘤清除不完全的问题。肠道微生物组与CAR T细胞疗法的治疗结果表现出强烈的相关性。然而，肠道菌群影响CAR T细胞治疗效力的潜在机制仍未确定。在本研究中，我们建立了一种同基因型CD19?小鼠淋巴瘤模型，可在CD19-CD28ζ CAR T细胞治疗后评估内源性免疫细胞和肠道菌群。通过单细胞转录组分析，我们报告CAR T细胞输注导致外周和肠道浸润的内源性CD8? T细胞向效应样表型激活。与此同时，16S RNA测序显示输注后肠道菌群发生了显著变化。肠道细菌的组成与内源性CD8? T细胞的激活状态以及对CAR T细胞疗法的反应性相关。更具体地说，我们确定Tu...ibacter和Parvibacter两种肠道细菌为有效CAR T细胞治疗的关键决定因素。在CAR T细胞治疗期间补充这些肠道菌种可带来更优越的抗肿瘤功效。此外，这两种菌株均促进了CAR T细胞治疗诱导的内源性CD8? T细胞激活，增强了其表达激活相关表面标志物的能力以及肿瘤裂解效力。总之，我们的结果表明肠道微生物组在CAR T细胞治疗后的内源性免疫激活中起着至关重要的作用，并为治疗干预提供了特定的靶点。

引言

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了巨大成功（1）。然而，尽管响应率很高，但相当一部分接受CAR T细胞治疗的患者仍面临疾病清除不充分和复发的挑战（2, 3），这凸显了识别影响CAR T细胞治疗结果的决定因素的重要性。尽管肿瘤细胞的抗原丢失和CAR T细胞有限的持久性被认为是导致治疗失败的关键贡献因素（4），但越来越多的研究兴趣聚焦于调节CAR T细胞功能的微环境成分，以及输注的CAR T细胞与内源性宿主免疫反应之间的相互作用。了解内源性免疫系统如何对CAR T细胞疗法产生反应，将决定进一步提高治疗效力的潜在途径。在CAR T细胞疗法之后，T细胞特异性的重编程涉及内源性免疫细胞向裂解性和促炎状态的肿瘤浸润和激活（5）。在临床前模型中，CAR T细胞疗法已被证明可增强内源性T细胞和髓系细胞的募集和激活（5, 6）。此外，人们观察到良好的CAR T细胞治疗结果与内源性T细胞的存在之间存在强烈相关性，这些T细胞的特点是耗竭标志物表达较低，具有增强的记忆和组织驻留特性，以及具有增强激活和抗原呈递能力的树突状细胞（5）。这些研究表明，CAR T细胞治疗后内源性T细胞的数量和功能变化在治疗疗效和长期结果中起着至关重要的作用。然而，CAR T细胞治疗后的全身免疫重塑机制，尤其是内源性T细胞激活的机制，仍有待完全阐明。肠道菌群是免疫系统的关键调节因子，已有研究表明肠道菌群与肿瘤的发生发展、免疫逃逸和治疗反应性相关（7–9）。临床前研究表明，肠道微生物组可能影响免疫治疗（包括CAR T细胞疗法）的抗肿瘤功效。广谱抗生素可延长CAR T细胞在体内的持久性（10），口服万古霉素增强了肿瘤控制，可能是通过激活内源性CD8? T细胞和树突状细胞实现的（11）。临床研究进一步强调了肠道菌群组成会影响CAR T细胞疗效。抗生素暴露，特别是广谱抗厌氧菌药物，与微生物群多样性降低和更差的生存率相关（12），而多样化的共生菌群似乎是最佳治疗反应所必需的。CAR T细胞治疗后获得良好反应（R）的患者表现出独特的微生物和代谢特征，其特点是高α多样性和特定类群富集（13, 14）。例如，某些共生菌，如长双歧杆菌和嗜黏蛋白阿克曼菌，与更好的治疗效果相关，可能是通过增强CAR T细胞质量或代谢适应性实现的（15, 16）。这些发现激发了人们对治疗干预的兴趣，包括粪便微生物群移植（FMT）和定义明确的细菌联合体（益生菌），以优化宿主环境进行免疫治疗（17, 18）。然而，尽管有利的微生物群配置对CAR T细胞性能至关重要，但其对治疗后内源性免疫系统协调反应的具体影响在很大程度上仍未被表征。考虑到肠道菌群在免疫调节中的重要作用，我们试图探讨CAR T细胞治疗后肠道微生物组的改变是否以及如何通过增强内源性免疫反应来贡献于治疗功效。利用具有完全正常免疫系统的同基因小鼠模型，我们对CAR T细胞治疗期间肠道菌群的动态变化进行了全面调查，并揭示了肠道微生物组成与内源性CD8? T细胞激活特征之间的相关性。最终，我们能够识别出在CAR T细胞输注后直接促进内源性CD8? T细胞激活的特定细菌。口服补充这些细菌可增强CAR T细胞治疗效力。重要的是，我们发现外源性补充微生物代谢物丁酸盐也能导致内源性T细胞强烈激活并增强治疗功效。这些发现为CAR T细胞与内源性免疫之间的相互作用提供了关键见解，也为通过微生物或代谢物补充来增强CAR T细胞疗法抗肿瘤功能的潜在策略提供了参考。

材料与方法

KA539血液肿瘤模型

6-8周龄C57BL/6小鼠（购自GemPharmatech公司，RRID:MGI:5652309）在接受4.5 Gy照射后4至20小时经静脉途径接种肿瘤细胞（2 × 10?）。肿瘤接种后第9天，静脉注射制备好的小鼠CAR T细胞（2-4 × 10?）。所有小鼠均饲养在浙江大学良渚实验室疾病模拟与动物模型平台，该设施为无特定病原体（SPF）级别动物设施，温度维持22°C，湿度55%。提供标准实验室饲料和高压灭菌水，环境保持12小时光照/12小时黑暗循环。实验前，所有小鼠在相同的SPF条件下适应2周。为了比较不同小鼠之间的CAR T细胞疗效，在肿瘤细胞接种前即开始采用单笼饲养策略贯穿整个实验过程。在CAR T细胞治疗前后采集血液样本，动物安乐死后进行骨髓和结肠样本分析。时间点见各图例。生物发光成像方面，小鼠经腹腔注射100 μL 15 mg/mL D-荧光素（Yeasen，40901ES08），使用IVIS成像系统（IVIS Lumina III，PerkinElmer）测量肿瘤负荷。动物实验获得浙江大学实验动物福利与伦理委员会的伦理批准（AP代码：ZJU20220041）。

B16-CD19实体肿瘤模型

6-8周龄C57BL/6小鼠皮下接种5 × 10? CD19过表达的B16F10细胞，并照射2.5 Gy。肿瘤接种后第6天，瘤内注射小鼠CD19 CAR T细胞（1 × 10?）。肿瘤体积达到2,000 mm3时，处死小鼠。

细菌灌胃和丁酸盐补充

Tu...ibacter（TURI）、Odoribacter（ODOR）和Parvibacter（PARV）培养至浓度达到10? CFU/mL，经麦氏比浊法验证。每只小鼠经口服灌胃给予200 μL细菌悬液，对照组灌胃200 μL补充0.5 g/L L-半胱氨酸和0.2 g/L硫化钠的PBS，按照先前报告的方法（19）进行。对于丁酸盐补充，将丁酸钠以100 mmol/L的浓度加入饮水中，如先前所述（20）。

丁酸盐补充

对于体外丁酸盐补充，从荷瘤（KA）小鼠脾脏分离的内源性T细胞在CAR T细胞与肿瘤细胞共培养条件下（Transwell实验）进行刺激，同时补充5 mmol/L丁酸钠或水。对于体内丁酸盐补充，从肿瘤接种开始，小鼠饮水中给予浓度为100 mmol/L的丁酸盐，对照组饮用pH匹配的水。

细胞培养

Platinum-E（Plat-E，RRID:CVCL_B488）于2023年由西湖大学谢启实验室赠送获得，小鼠肿瘤细胞系KA539（含转导基因Eμ-Myc）于2019年由中国科学技术大学王锦荣实验室赠送获得（21）。Plat-E细胞在90% DMEM（Corning）和10% FBS（Gibco）中维持，而KA539细胞在45% DMEM（Corning）、45% Iscove改良Dulbecco培养基（Corning）、10% FBS（Gibco）和β-巯基乙醇（Sigma M6250）中维持。细胞系鉴定由基因检测生物技术有限公司完成，所有细胞系均使用支原体检测试剂盒（Vazyme，D101-01）确认无支原体污染。KA539细胞在冻融后1至3周内用于实验。对于逆转录病毒包装，解冻后的Plat-E细胞在传代3至7次之间使用。小鼠T细胞在完全培养基RPMI 1640（Corning）、1 mmol/L丙酮酸钠（Sigma，S8636）、非必需氨基酸（Sigma，M7145）、50 μmol/L β-巯基乙醇、青霉素/链霉素溶液（Solarbio，P1400）和100 U/mL小鼠IL2（Novoprotein，CK24）中培养。

小鼠CAR T细胞制备

CAR构建体由靶向小鼠CD19的单链可变片段、CD8α跨膜域、CD28共刺激域和CD3ζ域组成。构建体中包含mCherry报告基因，通过内部核糖体进入位点分隔。CAR构建体的示意图见补充图S1A。（有关详细序列信息，请参阅补充表S1。）Plat-E细胞以每个10 cm2培养皿3 × 10?个细胞的密度接种。转染pcl-Eco（RRID:Addgene_12371）包装载体和编码逆转录病毒CAR构建体（Mo-MuLV骨架）的质粒DNA与聚乙烯亚胺（Yeasen），转染后48和72小时收集病毒上清液。小鼠T细胞转导方案采用自先前报告的方法（22）。简而言之，从C57BL/6小鼠中取出脾脏，使用研钵匀浆以获取脾细胞。使用红细胞裂解液（BioLegend）分离淋巴细胞，随后使用EasySep小鼠T细胞分离试剂盒（STEMCELL）按照制造商的方案获取T细胞。然后将Dynabeads小鼠T细胞激活CD3/CD28用于T细胞扩增和激活（Gibco）加入新鲜T细胞培养基中，并与小鼠T细胞混合（T细胞/磁珠 = 1:1）。刺激20至24小时后，在纤连蛋白包被的24孔板中用病毒上清液对T细胞进行转导（每1 × 10? T细胞使用3 mL上清液）。随后将小鼠T细胞在新鲜T细胞培养基中维持。转导后2天去除磁珠，并在该时间点检测转导率。

细菌16S rRNA基因测序

按照制造商说明使用FastPure粪便DNA分离试剂盒（MJYH）从小鼠粪便样本中提取总基因组DNA。DNA质量通过1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop ND-2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）验证。细菌16S rRNA基因的超变区V3和V4使用引物对338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）通过T100热循环仪（Bio-Rad）扩增。纯化后的扩增片段等摩尔混合，并按照Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd.的标准方案在Illumina NextSeq 2000 PE300平台（Illumina）上进行双端测序。

微生物群聚类分析

根据先前报告的方法（23），使用核心算法基于模糊C均值聚类的Mfuzz包对R（完全反应）、PR（部分反应）和NR（无反应）组的微生物群进行聚类分析（取每组中每个属的平均值）。

小鼠结肠免疫细胞分离

为获得结肠免疫细胞，从C57BL/6小鼠中分离结肠。冲洗掉粪便后，将组织切成小块并放入预热的消化培养基中，培养基中补充了胶原酶D（0.3 mg/mL；Roche）、DNase I（0.25 mg/mL；Roche）和dispase II（1.5 mg/mL；Sigma）。然后将混合物放入37°C孵育箱中剧烈振荡30分钟。

消化后，混合物通过 100 μm 细胞滤网，然后用不含钙镁的 Hank's 平衡盐溶液（Life Technologies）洗涤以获得细胞沉淀，随后重悬于 30% Percoll 溶液（GE Healthcare Life Sciences）中，分层于 80% Percoll 溶液之上，并在室温下以 1,000 g 离心 20 分钟。从不连续梯度界面收集活单核细胞。单细胞 RNA 文库制备与测序

从肿瘤未经历（WT）、荷瘤（KA）和 CAR T 细胞治疗（CART）组收集的小鼠结肠免疫细胞（每个样本由七至八只小鼠的结肠细胞混合组成）重悬于含 0.04% BSA 的 PBS 中。细胞活力通常超过 85%。使用 Chromium Single Cell 3′试剂试剂盒 v3（10x Genomics）制备单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）文库。细胞被捕获在液滴中以进行靶向细胞回收，随后进行 PCR 扩增和 3′基因表达文库构建。最后在 NovaSeq 平台（Illumina）上进行 150 bp 双端测序。使用 10x Genomics Cell Ranger 流程默认参数对原始 reads 进行解复用并比对至 Mus musculus mm10 参考基因组。所有后续单细胞分析均使用 Cell Ranger 和 Seurat 进行。单细胞 RNA 数据处理

使用 Seurat (v4.3.0) 分析 scRNA-seq 数据。初始质量控制筛选细胞（200–5,000 个基因，线粒体 reads <10%）和基因（在 >3 个细胞中表达），并使用 DoubletFinder 去除双联体。归一化后，通过数据整合校正三个样本间的批次效应。使用主成分分析（PCA）和均匀流形近似与投影（UMAP）进行降维。随后使用共享最近邻图和 Louvain 算法（分辨率 0.5）对细胞进行聚类。细胞类型注释

根据经典标记基因的表达对簇进行注释。对于结肠免疫细胞，应用 Cd3d、Cd4、Cd8a、Cd8b、Tcrg-C1、Tcrg-C4、Trdc、Mki67、Ncr1、Klrb1b、Klrb1c、Klrd1、Il7r、Id2、Cd19、Cd79a、Igha、Jchain、Lyz2、Csf1r 和 Aif1 作为聚类标记，鉴定出 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、循环 T 细胞、γδT 细胞、B 细胞、浆细胞、NK 细胞、ILCs 和单核吞噬细胞（MNP）。提取 T 细胞群体并进行重新聚类。基本上，我们根据几种经典标记区分 T 细胞亚群，包括包含 Cd27、Ccr7、Sell、Il7r 和 Lef1 的天真/记忆标记；包含 Cd69、Itgae、Itga1、Cxcr3 和 Nr4a1/2/3 的驻留标记；包含 Cd44、Klrg1、Cx3cr1、Gzmb、Gzma、Gzmk、Ifng、Tnf 和 Prf1 的效应标记；包含 Tigit、Entpd1、Havcr2、Ctla4、Lag3、Pdcd1、Eomes、Tox、Cd38、Batf、Prdm1、Il10ra、Cd244a、Cd160、Nfatc1 和 Smad2 的耗竭标记；包含 Xcl1、Tyrobp、Ikzf2、Fcer1g、Klrd1 和 Klrb1a 的 NK 样标记；以及增殖标记 Mki67。通过将 mCherry 报告基因的特异性序列添加到标准小鼠参考基因组以创建自定义参考，确定 CAR 阳性与 CAR 阴性细胞，并将包含一个或多个比对至 mCherry 序列的唯一分子标识符计数的细胞鉴定为 CAR 表达细胞。免疫评分评估

基于 Egf、Csf3、Csf2、Cxcl1、Ifna、Ifng、Il1b、Il1ra、Il2、Il5、Il6、Il8、Il10、Il12、Il13、Il17a、Il18、Il33、Cxcl10、Ccl2、Ccl3、Tnfa、Cxcl8、Cxcl9、Ccl5 和 Tgfb 的表达水平确定免疫评分，应用 VISION 软件包（24）。批量 RNA 测序与分析

用于 RNA-seq 分析的样本是从 KA 小鼠脾脏分离的原代 T 细胞，这些细胞在 Transwell 实验中接受了不同细菌上清液（TURI、PARV 和对照）的处理（每组由三个生物学重复组成）。按照制造商程序使用 TRIzol 试剂（Invitrogen）分离和纯化总 RNA。纯化、逆转录和 PCR 扩增后，所得 cDNA 文库的平均插入片段大小为 300 ± 50 bp。最后，我们按照供应商推荐方案在 Illumina NovaSeq 6000 上（LC-Bio Technology）进行了 2 × 150 bp 双端测序（PE150）。质量控制后，使用 Bowtie2 将 reads 比对至小鼠 GRCm39 参考基因组。然后利用 GRCm39 注释，通过极大期望法估算 RNA 测序来计算基因特征的原始 reads 计数。使用 DESeq2 软件包鉴定差异表达基因（DEG），筛选标准设定为校正 P 值 <0.05 且绝对 log2(fold change) > 0.5。使用 fgsea 软件包进行基因集富集分析（GSEA），以鉴定不同条件之间显著富集的通路。为进一步通路洞察，使用 clusterProfiler 软件包对 DEG 应用京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。基因集变异分析（GSVA），由 GSVA 软件包实现，量化了单个样本中预定义基因集的活性。免疫荧光染色

结肠组织固定于 4% 多聚甲醛中短期保存。石蜡包埋的结肠组织经过脱蜡和抗原修复过程。组织用 3% H2O2（用于封闭内源性酶）和 3% BSA 封闭，并与以下一抗孵育：抗 CD3（Cell Signaling Technology, 99940S, 1:100, RRID:AB_2755035），抗 CD8（Abcam, ab217344, 1:50, RRID:AB_2890649），抗 GZMB（Abcam, ab255598, 1:100, RRID:AB_2860567），和抗 NUR77（Invitrogen, MA5-32647, 1:200, RRID:AB_2809924）。然后将 TYR-651(Pinuofei Biotechnology, PN0102, 1:1,000)，TYR-488 (Pinuofei Biotechnology, PN0100, 1:1,000)，TYR-555 (Pinuofei Biotechnology, PN0101, 1:1,000)，和 DAPI (Beyotime Biotechnology, C1002, 1:10,000) 溶液在切片中孵育。图像使用 ZEISS LSM 900 扫描，并使用 CaseViewer 2.3 观察。流式细胞术

使用 LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific) 用于透化细胞和 DAPI (Beyotime Biotechnology, C1002, 1:10,000) 用于活细胞来排除死细胞。染色前，通过抗 CD16/32 单克隆抗体（克隆 93; BioLegend, RRID:AB_2783138）对细胞悬浮液进行 Fc 封闭。染色使用以下抗体：CD45-岩藻黄素 - 叶绿素蛋白 - 花青素 5.5 (PercCP/Cy5.5) (BioLegend, 克隆：30-F11, RRID:AB_893340)，CD3-藻红蛋白 (APC) (BioLegend, 克隆：17A2, RRID:AB_312677)，CD19-藻红蛋白 - 花青素 7 (PC7) (eBioscience, 克隆：eBio1D3, RRID:AB_657664)，CD4-藻红蛋白 - 花青素 7 (AC7) (BioLegend, 克隆：RM4-5, RRID:AB_312727)，CD8-明亮紫色 (BV)605 (BioLegend, 克隆：53-6.7, RRID:AB_2562609)，CD25-PC7 (BioLegend, 克隆：PC61, RRID:AB_312864)，CD69-藻红蛋白 (PE) (BioLegend, 克隆：HL2F3, RRID:AB_313110)，CD45.1-PerCP/Cy5.5 (BioLegend, 克隆：A20, RRID:AB_893346)，CD45.2-Alexa Fluor 700 (AF700) (BioLegend, 克隆：104, RRID:AB_493731)，IFNγ-APC (BioLegend, 克隆：XMG1.2, RRID:AB_315403)，TNFα (BioLegend, 克隆：MP6-XT22, RRID:AB_2562902)，IL2-PE (BioLegend, 克隆：JES6-5H4, RRID:AB_315302)，CD11b-BV421 (BioLegend, 克隆：M1/70, RRID:AB_2562904)，CD11c-BV605 (BioLegend, 克隆：N418, RRID:AB_2562415)，和 MHC class II-异硫氰酸荧光素 (FITC) (eBioscience, 克隆：M5/114.15.2, RRID:AB_465231)。分析使用 BD Fortessa 流式细胞仪（BD Biosciences）进行，并使用 FlowJo v10.4（BD Biosciences）分析。多重分泌组分析

除非图注另有说明，否则血清于 CAR T 细胞输注后第 5 天通过小鼠尾静脉收集。使用荧光编码微球（ABplex Mouse Multiplex Custom Panel, ABclonal Technology）通过流式细胞术微球阵列法定量分析细胞因子浓度。Transwell 实验

指示微生物在 Acidaminococcus fermentans 培养基 + 瘤胃液（1%）中培养至浓度达到 10^8 cfu/mL，然后离心收集上清液。内源性 T 细胞在磁珠细胞分选后从 KA 小鼠脾脏中收获。在 Transwell 实验中，将 CAR T 细胞和肿瘤细胞置于上室，将来自 KA 小鼠或未处理小鼠的内源性 T 细胞置于下室（CAR T 细胞、肿瘤细胞和内源性 T 细胞的比例为 1:1:2），并添加不同细菌的上清液。刺激 3 天后，通过流式细胞术、杀伤实验和 RNA-seq 检测内源性 T 细胞。体外细胞毒性试验

效应细胞（指示治疗组的 CD8+ T 细胞）和靶细胞（KA539 肿瘤细胞）在 96 孔 U 型底板中按指示的效应细胞与靶细胞（E:T）比例共培养。等量单独培养的靶细胞用作对照组。孵育 24 小时后，收集细胞并用 APC 偶联的抗小鼠 CD3 和 DAPI 染色。使用体积固定采集方法通过流式细胞术确定每孔存活肿瘤细胞（CD3?DAPI?GFP+）的绝对数量。特异性裂解百分比计算如下：[1 ? (共培养中活肿瘤细胞的绝对数量/对照中活肿瘤细胞的绝对数量)] × 100%。统计分析

免疫荧光图像使用 ImageJ 处理和量化。流式细胞术原始数据通过 FlowJo (v10.4) 分析。统计分析在 Prism 10 中进行，两组间差异通过非配对双尾 Student t 检验分析，而三组或以上组间差异通过单因素方差分析及多重比较检验分析。统计细节在相应的图注中描述。结果

CAR T 细胞治疗在同基因动物模型中重编程肠道微生物组

为探讨肠道微生物组在 CAR T 细胞治疗和 CAR T 细胞诱导的内源性免疫中的潜在作用，我们首先建立了一个同基因动物模型。经 4.5 Gy 全身照射后，C57BL/6 小鼠静脉接种 KA539 细胞，这是一种由 Eμ-Myc 驱动并表达内源性 CD19 的小鼠 B 细胞淋巴瘤细胞系。肿瘤接种九天后，施用靶向小鼠 CD19 的 CAR T 细胞，随后检测骨髓中的肿瘤负荷，以及外周血样本的流式细胞术分析和细胞因子评估（图 1A）。CAR T 细胞能够在此小鼠模型中扩增并介导抗肿瘤反应（图 1B–D；补充图 S1B）。然而，该模型中的 CAR T 细胞治疗未能介导长期抗肿瘤反应（图 1C 和 D），代表了临床上显著比例（约 50%）的患者表现为 PR（部分缓解）或 NR（无反应）的挑战。图 1. 查看大图 下载幻灯片 CART 同基因肿瘤模型中肠道微生物组的改变。A，代表建立同基因小鼠模型过程的示意图。通过流式细胞术分析小鼠外周血中的免疫细胞，血清细胞因子演变及生物发光成像。（DBCLS 的 Genomesequencer9 图标 https://togotv.dbcls.jp/en/pics.html 根据 CC-BY 4.0 授权；非移植版 https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Xi-Chen 的 Singlecell_droplet_overloading 图标 https://notarocketscientist.xyz 根据 CC0 授权 https://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0./）B，CAR T 细胞治疗后外周血中 CAR T 细胞的百分比。数据表示为均值 ± 标准误。C 和 D，CAR T 细胞输注后第 5、7 和 10 天小鼠的生物发光图像（C）和统计图（D）。数据表示为均值 ± 标准误。ns，无显著性；****，P < 0.0001，使用非配对 t 检验。E，柱状图描绘 WT、KA 和 CART 组肠道微生物组的α多样性，使用 Chao 指数。n = 20，*，P < 0.05；***，P < 0.001，使用 Kruskal–Wallis 检验。F，基于检测到的操作分类单元（OTU）显示各组明显聚类的 PCoA 图。G，不同组的β多样性分析；Y 轴表示β多样性距离值，P 值使用 Kruskal–Wallis 检验确定。n = 20。H，三组间差异富集的细菌。Y 轴表示利用 Kruskal–Wallis 检验用于 WT、KA 和 CART 组的?log10(P 值)；X 轴表示不同的细菌属，点的颜色表示每种细菌属的流行率，点的大小表示每种细菌属在总微生物群中的比例。PB，外周血；PCoA，主坐标分析；ROI，感兴趣区域。图 1. 查看大图 下载幻灯片 CART 同基因肿瘤模型中肠道微生物组的改变。A，代表建立同基因小鼠模型过程的示意图。通过流式细胞术分析小鼠外周血中的免疫细胞，血清细胞因子演变及生物发光成像。（DBCLS 的 Genomesequencer9 图标 https://togotv.dbcls.jp/en/pics.html 根据 CC-BY 4.0 授权；非移植版 https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Xi-Chen 的 Singlecell_droplet_overloading 图标 https://notarocketscientist.xyz 根据 CC0 授权 https://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0./）B，CAR T 细胞治疗后外周血中 CAR T 细胞的百分比。数据表示为均值 ± 标准误。C 和 D，CAR T 细胞输注后第 5、7 和 10 天小鼠的生物发光图像（C）和统计图（D）。数据表示为均值 ± 标准误。ns，无显著性；****，P < 0.0001，使用非配对 t 检验。E，柱状图描绘 WT、KA 和 CART 组肠道微生物组的α多样性，使用 Chao 指数。n = 20，*，P < 0.05；***，P < 0.001，使用 Kruskal–Wallis 检验。F，基于检测到的操作分类单元（OTU）显示各组明显聚类的 PCoA 图。G，不同组的β多样性分析；Y 轴表示β多样性距离值，P 值使用 Kruskal–Wallis 检验确定。n = 20。H，三组间差异富集的细菌。

y轴表示利用Kruskal-Wallis检验对WT、KA和CART组的?log10(P值)；x轴表示不同的细菌属；点的颜色表示各细菌属的流行度；点的大小表示各细菌属在总微生物群中的比例。PB，外周血；PCoA，主坐标分析；ROI，感兴趣区域。关闭图1。

随后，我们关注了该模型中CAR T细胞疗法后肠道微生物群的失调情况（12, 15, 16）。使用16S rRNA基因测序方法，我们首先揭示了WT、KA和CART动物组之间在门和属水平上的肠道微生物群差异（补充图S1C和S1D）。具体而言，肿瘤接种后群落丰富度下降，而CAR T细胞疗法后群落丰富度增加（图1E）。三组之间的β多样性通过主坐标分析（PCoA；图1F）和不加权组内平均法（UPGMA）分析（图1G）进行了描绘。Kruskal-Wallis检验显示三组之间存在显著差异，其中WT组与其他两组的差异大于CART与KA组之间的差异（图1G）。接下来，我们研究了三种治疗组之间显著变化的细菌。我们展示了基于其在总微生物群中比例的排名前50的细菌属。其中，37个属在三组治疗组之间表现出显著差异（P < 0.05；图1H）。在门水平上，拟杆菌门和脱硫杆菌门的丰度在肿瘤接种后下降，而在CAR T细胞治疗后增加；与此同时，疣微菌门表现出相反的趋势（补充图S1E）。在属水平上，Lachnospiraceae_NK4A136_group、Muribaculaceae和Desulfovibrionaceae、梭菌属和拟杆菌属在未接受CAR T细胞治疗的KA小鼠中丰度最低，而梭菌纲、TURI、Mucispirillum和ODOR的丰度在KA组中增加，而在CAR T细胞治疗后进一步升高（补充图S1F）。综上所述，我们建立了CAR T细胞疗法的同源模型，并揭示了CAR T细胞输注后肠道微生物群的变化。

CAR T细胞疗法重塑了肠道免疫环境和全身免疫状态

CAR T细胞疗法已被证实可诱导内源性免疫反应，这可能有助于改善治疗效果（5）。在我们的模型中，CAR T细胞治疗后的外周血、骨髓和结肠组织中检测到的外源性输注细胞数量极少（补充图S2A和S2B），表明内源性免疫细胞在介导充分抗瘤反应中起重要作用。因此，在证明了CAR T细胞输注后肠道微生物群的变化后，我们进一步研究了CAR T细胞治疗对内源性免疫细胞的影响。我们使用Percoll离心法从消化的结肠组织中分离免疫细胞，并进行了scRNA-seq分析。结肠淋巴细胞主要由T细胞（包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、循环T细胞和γδT细胞）、B细胞、浆细胞、NK细胞、固有淋巴细胞（ILC）和单核吞噬细胞（MNP）组成（图2A；补充图S2C）。各治疗组之间观察到各细胞类型相对比例的变化（图2B）。CD19 CAR T细胞疗法导致结肠B细胞急剧减少，scRNA-seq和流式细胞术结果均证实了这一点（图2B；补充图S2D）。在结肠淋巴细胞中未检测到表达CAR的T细胞，我们根据此前报道的各亚群标记对内源性T细胞进行了聚类分析（补充图S2E）。γδT细胞是最丰富的内源性结肠T细胞亚型，与之前的报告一致（25, 26）。重要的是，内源性CD8+ T细胞在CART组中显著富集（图2B）。更具体地说，一个效应T细胞（Teff）簇，其特征是表达Gzmb、Ifng和Tnfa，在CAR T细胞治疗后显示出富集（图2C；补充图S2E）。我们还观察到CART组中CD4+ T细胞的频率降低，这可能是由于CD8+ T细胞扩增导致的比例性减少（补充图S2F）。流式细胞术分析显示，结肠组织中肿瘤细胞几乎不可检测（补充图S2G）。

图2. CAR T细胞疗法后结肠和全身T细胞的免疫重编程。查看大图，下载幻灯片。A–F，WT、KA和CART组结肠免疫细胞的scRNA-seq分析。A，均匀流形近似和投影降维（UMAP）图，展示了结肠免疫细胞（从左到右）的不同细胞类型、结肠T细胞和结肠αβT细胞的组成。B，柱状图（左）和气泡图（右）展示了三组（WT、KA和CART）所有结肠免疫细胞中各细胞类型的相对比例。对于柱状图，所有细胞类型的比例均以WT组为基准进行标准化。对于气泡图，描绘了CART组与KA组（x轴）之间以及KA组与WT组（y轴）之间各细胞簇的相对丰度。C，柱状图（左）和气泡图（右）展示了三组（WT、KA和CART）所有结肠αβT细胞中各细胞类型的相对比例。D和E，WT、KA和CART组中Tnf（D）和Ifng（E）的表达水平，分别以UMAP图（左）和提琴图（右）表示。显著性水平通过Wilcoxon秩和检验计算：ns，无显著性差异；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001。F，CD8+（Teff）细胞在WT、KA和CART组中的特征评分；基因集来源于基因本体论生物过程（GOBP）细胞因子反应（上）和GOBP细胞周期调控（下）。显著性水平通过Wilcoxon秩和检验计算：***，P < 0.001。G和H，CAR T细胞输注后第5天KA组和CART组外周血免疫细胞的scRNA-seq分析。G，UMAP图（左）和堆叠柱状图（右）展示了各组中不同细胞类型的组成。H，KA组与CART组外周血CD8+ T细胞GSVA评分的热图。MNP，单核吞噬细胞；PB，外周血；Tfh，T滤泡辅助细胞；Tn，初始T细胞；Trm，组织驻留记忆T细胞。关闭图2。

我们进一步分析了三组之间内源性T细胞中激活相关基因和通路的差异表达水平。两种主要的炎症细胞因子TNFα和IFNγ主要在CART组的CD8+ Teff、CD8+ 效应记忆T细胞（Tem）和CD4+ Tem簇中升高（图2D和E）。介导Teff分化的转录因子Nr4a1的表达在CART组中上调（补充图S3A）。尽管Teff簇在CART组中富集，但这些细胞同时上调了与细胞因子反应、细胞周期和一般免疫激活相关的通路（图2F；补充图S3B）。在CART组中几乎所有免疫细胞亚群的整体免疫评分均升高，其中CD8+ Teff亚群中升高最为显著（补充图S3C和S3D）。与此一致，CART组的结肠淋巴细胞能够产生更多的炎症细胞因子，包括IL2、IL6、IL17A、IFNγ和TNFα（补充图S3E）。多重免疫荧光也揭示了CAR T细胞输注后结肠中CD3+、CD8+ T细胞诱导表达细胞毒性分子GZMB（补充图S3F）。鉴于观察到的结肠内源性免疫细胞激活，我们进一步检查了外周血中的免疫细胞特征。scRNA-seq数据显示，尽管CAR T细胞未在循环中持续存在，但内源性CD8+ T细胞在治疗后表现出显著扩增（图2G）。与结肠淋巴细胞类似，外周淋巴细胞亚群也表现出免疫评分升高，其中CD8+ T细胞升高最为显著（补充图S3G）。在分析外周血中的内源性CD8+ T细胞时，我们发现炎症反应相关通路，包括IL6、IFNγ和TNFα的下游信号通路，均在CART组中上调（图2H）。流式细胞术进一步阐明了CD8+ T细胞与CD4+ T细胞的比例以及CD8+ T细胞中IFNγ和GZMB的表达水平（补充图S4A）。我们还观察到CART小鼠中细胞因子水平显著升高，包括IL2、IL6、IL1β和IL17A（补充图S4B）。重要的是，CAR T细胞在KA Rag1?/?小鼠中的治疗效果不太显著（补充图S4C和S4D），表明内源性适应性免疫反应在抗肿瘤中的关键作用。此外，我们分离了WT、KA和CART组的脾脏CD8+ T细胞，进行针对KA539肿瘤细胞的体外细胞毒性实验。在E:T比例为1:5和1:10时，CART组来源的内源性CD8+ T细胞表现出显著增强的细胞毒性，证实了CAR T细胞治疗激发了内源性抗肿瘤T细胞活性（补充图S4E）。总体而言，我们证明了在该同源模型中，CAR T细胞治疗导致内源性CD8+ T细胞的激活和功能恢复。

图2. CAR T细胞疗法后结肠和全身T细胞的免疫重编程。查看大图，下载幻灯片。A–F，WT、KA和CART组结肠免疫细胞的scRNA-seq分析。A，均匀流形近似和投影降维（UMAP）图，展示了结肠免疫细胞（从左到右）的不同细胞类型、结肠T细胞和结肠αβT细胞的组成。B，柱状图（左）和气泡图（右）展示了三组（WT、KA和CART）所有结肠免疫细胞中各细胞类型的相对比例。对于柱状图，所有细胞类型的比例均以WT组为基准进行标准化。对于气泡图，描绘了CART组与KA组（x轴）之间以及KA组与WT组（y轴）之间各细胞簇的相对丰度。C，柱状图（左）和气泡图（右）展示了三组（WT、KA和CART）所有结肠αβT细胞中各细胞类型的相对比例。D和E，WT、KA和CART组中Tnf（D）和Ifng（E）的表达水平，分别以UMAP图（左）和提琴图（右）表示。显著性水平通过Wilcoxon秩和检验计算：ns，无显著性差异；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001。F，CD8+（Teff）细胞在WT、KA和CART组中的特征评分；基因集来源于基因本体论生物过程（GOBP）细胞因子反应（上）和GOBP细胞周期调控（下）。显著性水平通过Wilcoxon秩和检验计算：***，P < 0.001。G和H，CAR T细胞输注后第5天KA组和CART组外周血免疫细胞的scRNA-seq分析。G，UMAP图（左）和堆叠柱状图（右）展示了各组中不同细胞类型的组成。H，KA组与CART组外周血CD8+ T细胞GSVA评分的热图。MNP，单核吞噬细胞；PB，外周血；Tfh，T滤泡辅助细胞；Tn，初始T细胞；Trm，组织驻留记忆T细胞。关闭图2。

内源性CD8+ T细胞激活与同源小鼠模型中CAR T细胞疗法的疗效相关

在此同源模型中，尽管采用相同的CAR T细胞给药策略，仍观察到抗瘤反应的差异，因此我们将CART小鼠分为三组：R、PR和NR（图3A和B）。通过生物发光成像以及外周血中的肿瘤细胞展示了CAR T细胞疗法的差异应答（图3B；补充图S5A）。外周血中CAR T细胞的数量在组间未显示显著差异（补充图S5A）。然而，CD8+/CD4+内源性T细胞的比例在R组中增加，同时CD8+ T细胞表达IFNγ和GZMB（补充图S5B）。包括IL1β、IFNγ、IL4和TNFα在内的血清细胞因子在R组中也表现为最高水平（图3C）。因此，同源模型中的抗肿瘤潜力与内源性CD8+ T细胞激活的程度相关。

图3. CAR T细胞疗法的疗效与内源性T细胞激活相关。

# 翻译

图3. 查看大图 下载幻灯片 CAR T细胞治疗的疗效与内源性T细胞的激活相关。A，对CAR T细胞治疗反应存在差异的KA小鼠的生物发光图像。所有小鼠均在肿瘤接种后第9天接受2×10?个CAR T细胞治疗。NR，n=6；PR，n=8；R，n=6。B，CAR T细胞输注后第0、3和5天通过生物发光定量肿瘤负荷。C，CAR T细胞输注后第5天不同反应组之间血清细胞因子水平的柱状图。使用单因素方差分析（ANOVA）计算显著性，*，P<0.05；**，P<0.01，比较R组与NR组。D，R、PR和NR组结肠中CD3e（黄色）、GZMB（绿色，左）和CD8a（红色，左）以及NR4A（红色，右）的免疫荧光染色。比例尺，50 μm。E，从三组中分离的结肠免疫细胞用CD3/CD28 Dynabeads刺激72小时后的细胞因子分泌水平。F和G，R、PR和NR组结肠免疫细胞的流式细胞术分析，显示CD8+/CD4+ T细胞的相对比值（F）及CD45+免疫细胞中CD8+ T细胞的百分比（G）。*，P<0.05；**，P<0.01，使用单因素方差分析比较所示各组。

图3. 查看大图 下载幻灯片 CAR T细胞治疗的疗效与内源性T细胞的激活相关。A，对CAR T细胞治疗反应存在差异的KA小鼠的生物发光图像。所有小鼠均在肿瘤接种后第9天接受2×10?个CAR T细胞治疗。NR，n=6；PR，n=8；R，n=6。B，CAR T细胞输注后第0、3和5天通过生物发光定量肿瘤负荷。C，CAR T细胞输注后第5天不同反应组之间血清细胞因子水平的柱状图。使用单因素方差分析（ANOVA）计算显著性，*，P<0.05；**，P<0.01，比较R组与NR组。D，R、PR和NR组结肠中CD3e（黄色）、GZMB（绿色，左）和CD8a（红色，左）以及NR4A（红色，右）的免疫荧光染色。比例尺，50 μm。E，从三组中分离的结肠免疫细胞用CD3/CD28 Dynabeads刺激72小时后的细胞因子分泌水平。F和G，R、PR和NR组结肠免疫细胞的流式细胞术分析，显示CD8+/CD4+ T细胞的相对比值（F）及CD45+免疫细胞中CD8+ T细胞的百分比（G）。*，P<0.05；**，P<0.01，使用单因素方差分析比较所示各组。 关闭图3。

为了进一步验证结肠免疫环境及其与CAR T细胞治疗反应性的关联，我们分离了这三组的结肠免疫细胞。流式细胞术结果显示，R组的CD8+/CD4+ T细胞比值以及CD8+ T细胞/CD45+免疫细胞比值均更高（图3F和G）。与此一致，多重免疫荧光显示R组中T细胞总量以及CD8+ T细胞数量较高，同时T细胞中GZMB和NR4A的表达水平升高（图3D）。此外，结肠T细胞分泌的炎症细胞因子，包括IL2、IL12P70和TNFα，在R组中上调（图3E）。总之，我们发现全身或局部结肠CD8+ T细胞的激活状态与CAR T细胞治疗的疗效相关，表明重编程内源性T细胞活性对于有效的CAR T细胞治疗至关重要。

**肠道菌群组成与CAR T细胞治疗反应相关**

鉴于肠道免疫系统受到肠道微生物群的强烈影响（27），对CAR T细胞治疗的不同反应提示肠道微生物群与CAR T细胞诱导的内源性T细胞反应激活之间可能存在潜在关联，并进而影响抗肿瘤疗效。为了进一步了解肠道微生物组与CAR T细胞治疗疗效的相关性，我们使用16S rRNA基因测序来评估三种CART动物组（R、PR和NR）的肠道微生物组成。尽管三组之间基于Shannon指数的α多样性未观察到显著差异（图4A），但每组约有7%至17%的独有操作分类单元（OTU）占检测到的总数（CAR T细胞治疗后；补充图S6A）。PCoA展示了这三组之间的差异（图4B）。UPGMA分析描绘了肠道微生物结构的β多样性，显示这三组之间无显著差异（图4C）。补充图S6B和S6C分别展示了CAR T细胞治疗后不同组小鼠在门和属水平上的肠道微生物组成概况。

图4. 查看大图 下载幻灯片 CAR T细胞治疗的疗效与肠道微生物组组成相关。A，柱状图展示三组不同反应性的肠道微生物组α多样性。数据表示为均值±SEM。R：n=6，PR：n=8，NR：n=6。B，主坐标分析（PCoA）图，显示各组基于其检测到的操作分类单元（OTU）的明显聚类。C，不同组的β多样性分析；y轴表示β多样性距离值，图中显示了所使用的统计检验方法及相应的P值。数据表示为均值±SEM。D，R、PR和NR组微生物组的聚类分析。热图中每一列代表各组中每个属的相对值。E和F，柱状图显示在不同组之间差异最显著的属水平细菌，R与NR之间（E），R与PR之间（F），如图中所示。微生物组的差异分析使用DESeq2进行。G，三组不同反应性的差异富集细菌。y轴表示使用Kruskal-Wallis检验对R、PR和NR组计算的-log??(P值)，x轴表示不同的细菌属，点的颜色表示每个细菌属的流行度，点的大小表示每个细菌属在总微生物组中的比例。

图4. 查看大图 下载幻灯片 CAR T细胞治疗的疗效与肠道微生物组组成相关。A，柱状图展示三组不同反应性的肠道微生物组α多样性。数据表示为均值±SEM。R：n=6，PR：n=8，NR：n=6。B，主坐标分析（PCoA）图，显示各组基于其检测到的操作分类单元（OTU）的明显聚类。C，不同组的β多样性分析；y轴表示β多样性距离值，图中显示了所使用的统计检验方法及相应的P值。数据表示为均值±SEM。D，R、PR和NR组微生物组的聚类分析。热图中每一列代表各组中每个属的相对值。E和F，柱状图显示在差异组之间差异最显著的属水平细菌，R与NR之间（E），R与PR之间（F），如图中所示。微生物组的差异分析使用DESeq2进行。G，三组不同反应性的差异富集细菌。y轴表示使用Kruskal-Wallis检验对R、PR和NR组计算的-log??(P值)，x轴表示不同的细菌属，点的颜色表示每个细菌属的流行度，点的大小表示每个细菌属在总微生物组中的比例。 关闭图4。

然后我们利用Mfuzz包进行聚类分析，揭示不同治疗效果组之间微生物组成存在显著差异（图4D）。簇三中的微生物在R组中丰度最高，而簇4中的微生物主要富集于NR组中。将R组与其他两组进行比较，我们发现特定微生物组的富集，包括Faecalibaculum、Monoglobus、Anaerofustis、PARV、TURI和ODOR（图4E和F）。我们还确认照射不会改变这些菌株的丰度（补充图S6D）。此外，簇4中的分类群如Candidatus Arthromitus、Jeotgalicoccus、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Streptococcus在NR组中富集（补充图S6E）。我们进一步描绘了这些不同反应组之间差异最大的细菌属（P<0.3；图4G），共确定了43个属。为了进一步研究这些微生物改变在CAR T细胞治疗患者中的转化相关性，我们重新分析了此前在我们中心获得的临床CAR T细胞患者肠道微生物组的16S rRNA测序数据（16）。TURI和PARV被发现高度富集于达到完全缓解（CR）或非常好的部分缓解（VGPR）的患者中，而Streptococcus在NR组中显著富集（补充图S6F）。总之，这些发现验证了具有不同CAR T细胞治疗反应性水平的小鼠中肠道微生物组组成的显著差异，表明寻找能够激活内源性T细胞的关键细菌物种的重要性。

**CAR T细胞治疗后，Turicibacter和Pavibacter作为免疫环境重塑的关键贡献者被鉴定**

为了找到对CAR T细胞治疗效果贡献的关键细菌，我们特别关注符合以下标准的物种：(i) 在不同治疗组（WT、KA和CART）之间显示显著差异（P<0.05）或在不同反应性（R、PR和NR）之间差异最大的细菌属（P<0.3）；(ii) Mfuzz分析不同反应组中簇三内的细菌属，在R组中呈现最高丰度；以及(iii) 在所有已确定的分类群中丰度>0.2%。我们能够识别出五个细菌属，其由Mfuzz包计算的成员分数始终表明肠道细菌属数量与CAR T细胞治疗反应之间的相关性（图5A）。

图5. 查看大图 下载幻灯片 鉴定能够减缓肿瘤进展的微生物。A，鉴定与CAR T细胞治疗疗效相关的特定微生物的流程图。取在治疗组或反应性组（蓝色圆圈）中显示差异的属与在R组中富集的簇三中的属（橙色圆圈）的交集。从交集中，最终选择了在总微生物组中比例大于0.2%的属。在识别出的五个属中，一个没有明确的属名，选择了三个在R组中成员分数较高的属进行后续实验。B，体内评估可能影响CAR T细胞治疗疗效的特定微生物的示意图。C和D，CAR T细胞治疗前1天和治疗后5天小鼠的生物发光图像。显示了代表性生物发光图像（C）及通过平均发光计算肿瘤负荷定量的计算图（D）。ns，不显著；*，P<0.05，使用单因素方差分析（ANOVA）比较所示各组。数据表示为均值±SEM。n=8。E，四组治疗组的生存分析，使用log-rank检验分析，**，P<0.01。F和G，外周血（F）和结肠（G）中内源性CD8+ T细胞的IFNγ、TNFα和IL2表达，经佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）/离子霉素刺激后从不同组中检测。ns，不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001，使用单因素方差分析。数据表示为均值±SEM。PB，外周血；ROI，感兴趣区域。

图5. 查看大图 下载幻灯片 鉴定能够减缓肿瘤进展的微生物。A，鉴定与CAR T细胞治疗疗效相关的特定微生物的流程图。取在治疗组或反应性组（蓝色圆圈）中显示差异的属与在R组中富集的簇三中的属（橙色圆圈）的交集。从交集中，最终选择了在总微生物组中比例大于0.2%的属。在识别出的五个属中，一个没有明确的属名，选择了三个在R组中成员分数较高的属进行后续实验。

图5. 关闭图5。

B，体内评估特定微生物群对CAR T细胞疗法疗效影响的示意图。C和D，CAR T细胞疗法前1天和疗法后5天的小鼠生物发光成像图。展示了代表性生物发光成像图（C）和通过平均发光度计算的肿瘤负荷定量图（D）。ns，无显著差异；*，P < 0.05，使用单因素方差分析（ANOVA）比较指定组别。数据以均值±标准误（SEM）表示。n = 8。E，四个治疗组的生存分析，使用log-rank检验分析，**，P < 0.01。F和G，不同组别中经刀豆胺素12-肉豆蔻酸酯13-乙酰酸酯/佛波酯-离子霉素刺激后检测的外周血（F）和结肠（G）内源性CD8+ T细胞中IFNγ、TNFα和IL2的表达。ns，无显著差异；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001，使用单因素方差分析。数据以均值±SEM表示。PB，外周血；ROI，感兴趣区域。关闭图5。为进一步验证所鉴定细菌在CAR T细胞介导的内源性T细胞激活中的功能，我们应用了体内实验，使CART小鼠通过口服灌胃接受单一细菌（图5B）。在该模型中，我们特别关注TURI、ODOR和PARV，因为它们在R组中的成员评分较高且易于获取。通过生物发光成像分析不同治疗组小鼠的肿瘤负荷，并通过流式细胞术分析外周血和结肠组织中的免疫细胞。在这三种细菌中，TURI和PARV对CAR T细胞疗法疗效的影响更为显著，降低了治疗动物的肿瘤负荷（图5C和D）。口服补充TURI和PARV能够延长CAR T细胞疗法后KA小鼠的生存期（图5E）。一致地，当分析外周血和结肠中内源性T细胞的激活状态时，我们发现灌胃细菌，特别是TURI和PARV，增强了CD8+ T细胞产生细胞因子（包括IFNγ、TNFα和IL2）的能力（图5F和G），表明补充特定肠道细菌可诱导内源性T细胞的激活。据报道，TURI可产生丁酸并调节免疫功能（28）。为检测该代谢物在CAR T细胞诱导的内源性T细胞激活中的潜在功能，我们将丁酸钠加入饮用水中给予接受CAR T细胞治疗的KA小鼠（补充图S7A）。在该实验中，为排除治疗结果改善是由非特异性细菌效应或不依赖T细胞的直接抗肿瘤效应所驱动的可能性，我们在不输入CAR T细胞的情况下给KA小鼠补充TURI或丁酸，并另设一组补充无关菌株大肠杆菌的CART小鼠。我们首先确认单独补充细菌或丁酸并不表现出抗肿瘤效应。当与CAR T细胞输入联合使用时，补充TURI或丁酸（而非大肠杆菌）的小鼠表现出显著的肿瘤消退（补充图S7A–S7C）。同时，这些组的输注后内源性T细胞表现出更强的细胞因子分泌能力（补充图S7D），这些组的小鼠也表现出延长的生存期（补充图S7E）。在皮下B16-CD19肿瘤模型中也证明了TURI或丁酸补充对抗肿瘤疗效的类似改善（补充图S7F）。在我们的模型中，TURI组和丁酸组的全身丁酸水平均升高（补充图S8A）。此外，我们对骨髓中的内源性免疫细胞进行了分析，发现除CD8+ T细胞外，1型树突状细胞群也增加。相反，CD11b+髓系细胞群体的总体比例降低（补充图S8B）。功能评估证实了骨髓中内源性CD8+ T细胞活性增强，以细胞因子产生为标志（补充图S8C）。总之，我们的数据表明，特定肠道微生物群及其代谢物可增强CAR T细胞疗法后内源性CD8+ T细胞的激活并提高抗肿瘤效果。Turicibacter和Pavibacter直接促进内源性T细胞激活。为验证我们发现的具体细菌可进一步增强CAR T细胞诱导的内源性T细胞激活，我们利用Transwell实验建立了体外T细胞激活模型。将肿瘤刺激的CAR T细胞放置在上室，将KA小鼠的内源性T细胞放置在下室，该实验旨在评估在培养微生物群上清液中培养的内源性T细胞的激活情况（图6A）。我们发现，在TURI和PARV上清液中培养时，内源性CD8+ T细胞被更强地激活，CD25和CD69表达升高（图6B–E）。此外，经PARV和TURI上清液处理后，这些细胞对肿瘤细胞的杀伤能力也增强（图6F和G）。与作为阴性对照的大肠杆菌培养上清液相比，检测到类似的T细胞激活诱导（补充图S9A）。此外，如果内源性CD8+ T细胞来源于肿瘤未接触小鼠，或上室中缺乏肿瘤细胞-CAR T细胞共培养，则未观察到这种刺激效应（补充图S9A）。确实，KA小鼠的内源性CD8+ T细胞在肿瘤细胞-CAR T细胞共培养刺激下表现出激活，并被TURI上清液进一步增强（补充图S9A）。使用TURI的关键代谢物丁酸钠处理KA小鼠的CD8+ T细胞时也观察到了这种激活，表现为CD25和CD69表达升高和内源性CD8+ T细胞细胞毒性的增加（补充图S9B）。图6。PARV和TURI诱导内源性T细胞激活。A，Transwell实验研究细菌对内源性T细胞影响的示意图。B和C，流式细胞术图和统计图，显示PARV组和对照组之间CD8+ T细胞上CD25和CD69的表达。***，P < 0.001；****，P < 0.0001，使用非配对t检验。数据以均值±SEM表示。n = 3。D和E，流式细胞术图和统计图，显示TURI组和对照组之间CD8+ T细胞上CD25和CD69的表达。ns，无显著差异；**，P < 0.01，使用非配对t检验。数据以均值±SEM表示。n = 8。F和G，TURI（F）和PARV（G）组与对照组相比内源性T细胞对KA539肿瘤细胞在指定E:T比值下的细胞毒性。*，P < 0.05；***，P < 0.001；****，P < 0.0001，使用非配对t检验。数据以均值±SEM表示。n = 8。H和I，火山图，显示TURI与对照组（H）和PARV与对照组（I）之间内源性T细胞的差异表达基因；红点代表上调基因，蓝点代表下调基因。J和K，TURI与对照组之间T细胞细胞毒性和迁移相关通路的GSEA分析。L和M，PARV与对照组之间T细胞细胞毒性和迁移相关通路的GSEA分析。FC，折叠变化；MFI，平均荧光强度；NES，标准化富集评分。关闭图6。随后我们分析了内源性T细胞的转录组，发现与接受对照培养基处理的T细胞相比，接受细菌上清液处理的T细胞存在显著差异，如PCA分析所示（补充图S10A）。更具体地说，与接受细菌培养基的对照组（CTRL）相比，TURI组或PARV组中特定T细胞效应相关基因和趋化因子的表达升高（图6H和I）。TURI组中的T细胞上调了Ccl3、Ccl6和Cd44（图6H），而PARV组中的T细胞上调了Ccl5、Ifng和Cd69（图6I）。GSEA进一步揭示，两种细菌上清液处理均上调了与T细胞细胞毒性和迁移相关的通路（图6J–M）。这些T细胞还上调了与Toll样受体和NF-κB信号传导、蛋白质乙酰化、组蛋白修饰以及包括脂肪酸氧化和氧化磷酸化在内的关键代谢通路相关的路径（补充图S10B）。通过分析这些通路中的关键基因，还确认了T细胞激活、细胞毒性、迁移和增殖特征（补充图S11A）。一致地，KEGG通路富集分析和GSVA均显示TURI处理的T细胞中T细胞激活相关通路的上调，包括T细胞受体、TNF和趋化因子信号通路（补充图S11B和S11C）。在PARV处理的T细胞中观察到了炎症相关、趋化因子和细胞因子通路的上调（补充图S11D和S11E）。这些结果证明了肠道微生物群，特别是PARV和TURI，对内源性T细胞的直接影响，导致其激活增强，这可能是微生物群介导的同基因肿瘤模型中对CAR T细胞疗法应答增强的原因。讨论。肠道微生物群已被发现与不同个体对CAR T细胞疗法的差异性反应有关。治疗策略，包括饮食改变、粪菌移植以及下一代益生菌（如嗜黏蛋白阿克曼菌或定义的联合体SER-401），正在被探索以克服癌症免疫治疗的耐药性（17, 18, 29）。然而，尽管有这些进展，对微生物群-免疫治疗组合有反应的精确免疫细胞群体尚未被完全阐明。我们的研究建立了一个免疫功能完好的动物模型，揭示了内源性免疫激活在有效CAR T细胞疗法中的重要性，并突出了肠道微生物群在调节CAR T细胞后内源性CD8+ T细胞激活中的关键作用。我们确认了特定类型的肠道细菌PARV和TURI对内源性CD8+ T细胞的表型和功能激活以及对CAR T细胞疗法的后续反应均有所贡献，表明肠道微生物群、内源性CD8+ T细胞反应和治疗疗效之间存在联系。经过继转移的CAR T细胞与内源性免疫之间的相互作用可对治疗疗效产生抑制和刺激双重效应。内源性抑制性免疫细胞、免疫抑制性细胞因子和代谢物是CAR T细胞疗效的主要障碍，通过限制激活、浸润和持久性来发挥作用（30）。另一方面，内源性免疫在CAR T细胞疗法后的持久缓解中发挥着关键作用，这通常依赖于抗原扩展和CAR T细胞介导的肿瘤清除后宿主CD8+ T细胞的动员（31, 32）。在我们的同基因模型中，我们重现了CAR T细胞输入后的内源性T细胞激活，并观察到肠道微生物群、内源性T细胞激活和治疗疗效之间的相关性。

此外，利用体内补充和体外刺激实验，我们揭示了肠道菌群在CAR T细胞治疗的基础上进一步诱导内源性T细胞活化，表明肠道菌群是CAR T细胞输注后免疫重编程的关键调节因子。我们的研究还表明，内源性T细胞的活化状态可能是连接个体间异质性肠道菌群与CAR T细胞治疗差异性应答的关键事件。CD8? T细胞已被证实是肠道菌群发挥免疫调节作用的主要效应细胞之一。特定菌株或它们的代谢产物可以直接调节CD8? T细胞的代谢适应性，并通过芳基烃受体（33）和腺苷A2A受体（A2AR；参考文献7、14）等受体激活下游信号通路。肠道菌群还可以通过促进树突状细胞的活化和成熟，增强交叉提呈及随后的T细胞启动和扩增（34），或者抑制肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的免疫抑制功能（参考文献35），间接塑造CD8? T细胞反应。此外，微生物信号刺激宿主产生关键细胞因子，包括IL-12（36）、IFNγ（37）和IL-10（38），这些因子对于维持CD8? T细胞的效应功能和记忆形成至关重要。在我们的研究中，我们鉴定了特定的肠道微生物，包括PARV和TURI，它们对内源性CD8? T细胞产生了显著影响。与此一致，我们观察到血清炎症细胞因子水平升高，包括IFNγ和TNFα，以及IL-4，后者最近被发现可以增强CAR T细胞的效力（39）。在我们的模型中，改善的治疗反应也与Nr4a1表达增加相关，而Nr4a1是Teffs（效应性T细胞）的公认标志物（40）。尽管Nr4a1也标记耗竭性T细胞，但我们的结果进一步验证了这些内源性T细胞维持了功能并且能够有效消灭肿瘤细胞。因此，特定细菌能够促进内源性T细胞向一种特别具有功能性的效应状态分化，随后贡献了抗肿瘤效应。然而，我们的单细胞数据集存在一个关键局限性，即由于CD8? T细胞的强烈扩增，CD4? T细胞的捕获不足。尽管CAR T细胞输注后CD4? T细胞数量未显示显著变化，但其转录特征可能被重编程，正如其他研究报告的那样（41、42）。肠道微生物群对CAR T治疗后CD4?内源性T细胞的影响有待利用我们的模型在未来研究中进一步探讨。肠道菌群来源的代谢产物是免疫调节的关键介导者，其中短链脂肪酸是研究最为深入的之一。在病毒感染模型中，乙酸被发现通过ACSS2补充核内和细胞质中的乙酰辅酶A，从而增加组蛋白乙酰化和效应基因的可达性，增强CD8? Teff功能（43、44）。在体外T细胞培养中，丁酸和戊酸抑制I类组蛋白去乙酰化酶（HDAC），增强p70S6K乙酰化和rS6磷酸化，放大mTOR信号，从而增强CD8? T细胞细胞毒性，同时促进记忆潜能和长期持续性（45）。在免疫检查点抑制剂治疗模型中，丁酸通过抑制HDAC上调转录因子ID2，从而促进IFNγ和IL-12受体表达，增强CD8? T细胞活化，并在免疫原性肿瘤中与免疫检查点阻断联合使用时改善治疗疗效（46、47）。丁酸也被证实可以直接增强免疫缺陷模型中CAR T细胞的细胞溶解效力（48）。与这些先前的发现一致，我们发现丁酸产生菌或直接补充丁酸增强了CAR T细胞在我们同基因模型中的治疗功效。有趣的是，另一个丁酸产生菌门Lachnospiraceae在NR组中富集，这可能是由于其情境依赖性功能，也可能介导免疫抑制（49）。此外，鉴于我们的模型中CAR T细胞持续性有限，这种有益效应主要归因于内源性免疫的激活。确实，用TURI上清液刺激的内源性T细胞上调了与蛋白质乙酰化、组蛋白修饰、脂肪酸氧化和氧化磷酸化相关的通路。这一效应进一步支持了营养补充剂增强癌症免疫治疗的潜力。有趣的是，TURI补充使外周丁酸水平升高，效果与直接补充丁酸类似，尽管其在结肠局部可能还具备额外的免疫调节功能。区分补充微生物群与其代谢产物之间的功能差异需要未来更多临床研究。我们的结果还表明CAR T细胞治疗过程中存在潜在的器官间免疫交叉对话。确实，结肠和外周血的单细胞测序结果显示，CD8? T细胞的比例和功能活性同时增加。这些发现表明，CAR T细胞治疗后系统性免疫改变可能由微生物群来源的代谢产物或免疫细胞再循环介导。在检查点抑制剂治疗背景下，肌苷已被证明可以跨越肠屏障并发挥系统性作用，通过T细胞特异性A2AR信号通路促进Th1活化（7）。此外，已有发现表明在高肿瘤负荷条件下，CD8? T细胞可以在骨髓和肠道之间迁移以维持其抗肿瘤活性（50）。综上所述，我们的发现连同先前的研究，提供了以下见解：CAR T细胞治疗诱导系统性免疫改变，包括远端器官的免疫变化，这些改变与治疗结果相关。这一过程可能是情境依赖性和肿瘤模型依赖性的，而驱动这种系统性免疫重编程的关键机制仍有待阐明。总之，我们的研究揭示了免疫健全背景下CAR T细胞治疗的微生物依赖性。尽管先前临床研究已确定平衡微生物群与更优CAR T细胞治疗结果之间的关联，但我们的结果进一步强调了特定细菌在CAR T细胞治疗后内源性免疫活化中的功能。细菌或代谢产物补充能够增强CAR T细胞治疗的功效，表明它们作为预后标志物和用于治疗改善的靶标具有潜力，并指明了未来临床研究设计以改善细胞治疗结果的方向。

数据可用性

原始测序数据可在NCBI BioProject数据库中获取，登录号为PRJNA1327980、PRJNA1328041和PRJNA1328047。

作者披露

K. Hu报告在研究期间获得中国国家自然科学基金和浙江省自然科学基金的非资金支持。L. Jin报告在研究期间获得中国国家自然科学基金的非资金支持。Z. Feng报告在研究期间获得中国国家自然科学基金的非资金支持。M. Zhu报告在研究期间获得中国国家自然科学基金的非资金支持。D. Wang报告在研究期间获得中国国家自然科学基金、浙江省自然科学基金和浙江省重点研发计划的资助。H. Huang报告在研究期间获得中国国家自然科学基金和浙江省自然科学基金的非资金支持。其他作者未报告任何披露信息。

作者贡献

K. Hu：概念化、资源、数据管理、软件、形式分析、验证、调查、可视化、方法学、撰写初稿。L. Jin：数据管理、形式分析、验证、调查、方法学。Z. Feng：调查、方法学。Q. Yu：资源、数据管理、验证、方法学。X. Si：数据管理、验证、调查、方法学、项目管理。L. Ding：数据管理、调查。Y. Han：方法学。M. Zhu：资源、调查、方法学。C. Shi：资源、方法学。X. Zeng：概念化、资源。K. Wang：调查、方法学。J. Wei：资源、数据管理。Y. Lv：资源、数据管理。D. Kong：资源。L. Qin：验证。L. Yu：资金获取。L. Wang：资金获取。M. Zhang：资金获取。P. Qian：监督。Y. Hu：监督、资金获取。D. Wang：监督、资金获取、项目管理、撰写审稿和编辑。H. Huang：资金获取、项目管理。

致谢

本研究获得了国家自然科学基金专项基金（编号：82341206、82271874和82341205）、国家自然科学基金青年科学基金（编号：82522004）、中国国家杰出青年科学基金（编号：82425002）、浙江省重点研发计划（编号：2024C03156、2025C02075、2024SSYS0023、2024SSYS0024、2024SSYS0025和2023R01012）、浙江省自然科学基金（编号：LR25H080001）以及深圳市医学"三医融合"项目（编号：SZSM202111004）的支持。我们感谢浙江大学医学院核心设施Y. Huang、浙江大学医学中心核心设施B. Xu以及良渚实验室在流式细胞术方面提供的技术支持。我们也感谢浙江大学动物实验中心、疾病模拟与动物模型平台以及中国杭州浙江大学实验动物中心的成员们提供的支持和帮助。

注：本文的补充数据可在Cancer Immunology Research Online（http://cancerimmunolres.aacrjournals.org/）上获取。