基于分裂内切蛋白上清液介导蛋白质转接的模块化双特异性抗体体外组装平台

《Journal of Biological Engineering》：Assembly of bispecific antibodies in culture supernatants using split intein-mediated protein trans-splicing

**摘要**双特异性抗体（bsAbs）是一种重要的治疗模式，因为它可以同时结合两种不同的抗原，从而实现免疫细胞重定向和增强靶点特异性等机制。然而，传统的双特异性抗体生成方法需要对各个抗体组合进行反复克隆、表达和纯化，这限制了早期发现阶段的可扩展性和通量。在本研究中，我们开发了一种基于分裂内切蛋白介导的蛋白质转接的模块化、上清液为基础的体外双特异性抗体组装平台，能够在无需纯化前体模块的情况下生成具有功能的双特异性抗体。在该系统中，两种独立表达的前体模块scFv-Fc-IntN和HSA-IntC-scFv通过共价连接生成完整的scFv-Fc-scFv分子。在测试的内切蛋白组合中，共识快速DnaE（Cfa）IntN3/IntC3组合展现出最高的有效剪接效率。重要的是，尽管纯化的前体蛋白表现出组装不完全，但使用含前体的培养上清液进行反应显著提高了剪接效率，并通过消除中间纯化步骤简化了工作流程。利用这一优化的上清液策略，我们从多样的scFv和单域抗体模块生成了一个3×3矩阵的九种双特异性抗体构建体，展示了该平台的模块化和序列耐受性。一种剪接衍生的抗HER2×抗CD3双特异性抗体在分子排阻色谱和表观热稳定性方面表现出与重组表达对照相似的特征，保留了对HER2和CD3的结合能力，以HER2依赖性方式激活报告T细胞，并通过初级人T细胞介导了靶依赖性的细胞毒性作用。这一基于上清液的分裂内切蛋白平台为双特异性抗体的生成和组合筛选提供了一种快速、可扩展且保持功能的方法，应有助于下一代多特异性疗法的发现和优化。