CRISPR-Cas9敲除TdIBH1精细调控油菜素内酯代谢并重塑硬粒小麦株型与籽粒性状

《Plant Physiology and Biochemistry》：CRISPR-Cas9 knockout of IBH1 fine-tunes brassinosteroid metabolism and modulates plant architecture and grain traits in durum wheat

CRISPR-Cas9介导的TdIBH1基因敲除与硬粒小麦中油菜素内酯（BR）代谢的精细调控及植株结构和籽粒性状的调节相关联。TdIBH1功能缺失选择性地重塑了BR代谢，而非全面增加具有生物活性的BR含量。TdIBH1敲除增加了植株高度、节间伸长和叶片倾角。编辑后的品系表现出籽粒尺寸和千粒重（TGW）的增加，同时种子数量并未减少。因此，TdIBH1代表了改良小麦株型和籽粒相关性状的一个潜在靶点。

研究背景与研究目的

油菜素内酯（Brassinosteroids, BRs）是一类在植物细胞伸长、分裂和分化中发挥核心作用的甾醇类激素，对作物株型塑造和产量形成至关重要。然而，直接操控BR合成或受体感知通常导致严重的多效性效应，如矮化或发育缺陷。在禾本科作物中，精准调节BR信号输出水平而非彻底改变其整体强度，已被证明可带来农艺优势，例如水稻中弱等位基因OsBRI1导致的直立叶型适于密植，以及大麦uzu突变体的半矮化抗倒伏特性。因此，寻找能够精细调节BR信号的分子节点成为育种改良的重要策略。IBH1（ILI1 Binding bHLH protein 1）作为BR信号通路下游的一个转录抑制因子，通过与DNA结合的bHLH转录因子异源二聚化来抑制细胞伸长和胁迫响应基因的表达，扮演着分子“刹车”的角色。尽管IBH1在模式植物和二倍体谷物中已有研究，但其在多倍体硬粒小麦（Triticum turgidum ssp. durum）中的功能尚不明确。为此，本研究旨在通过CRISPR-Cas9技术敲除硬粒小麦中的TdIBH1基因，评估其在BR相关生长反应中的作用，并探索其作为改善株型和籽粒性状分子靶点的潜力。

主要研究方法

研究人员首先利用同源比对工具在硬粒小麦（品种Svevo）基因组中鉴定出两个TdIBH1同源等位基因（位于2A和2B染色体）。随后，设计四组引导RNA（gRNA）并组装成两个CRISPR-Cas9二元载体（Construct-1含gRNA-1和gRNA-3；Construct-2含gRNA-2和gRNA-4），通过农杆菌介导法转化硬粒小麦品种Svevo的未成熟胚。为提高转化效率，采用了GRF4-GIF1嵌合蛋白和热激诱导的Cre/lox重组系统以实现转基因后标记基因的切除。对获得的T₀代再生植株进行下一代测序（NGS）以检测编辑事件，并通过Sanger测序确认T₁代的突变。此外，通过qRT-PCR分析BR通路相关基因的表达，采用超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）定量内源BR代谢物，并对T₂代植株进行了系统的形态学和产量相关性状的表型鉴定。

研究结果

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  TdIBH1同源基因的计算机鉴定与CRISPR-Cas9编辑：研究人员在硬粒小麦Svevo基因组中鉴定出两个TdIBH1同源等位基因（TRITD2Av1G270700和TRITD2Bv1G233900），各包含一个编码201个氨基酸蛋白的单外显子。通过CRISPR-Cas9编辑，获得了多个纯合双突变的T₀代株系，其中三个独立株系（I20-1, I35-3, I40-1）被选育至T₁代并确认为无转基因的纯合突变体。
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  TdIBH1突变蛋白的结构与功能预测：蛋白质序列比对和结构建模表明，CRISPR诱导的移码突变导致TdIBH1蛋白截短，丧失了关键的ILI1结合结构域，这些截短的蛋白预计将丧失功能。
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  TdIBH1及BR通路基因的表达分析：qRT-PCR结果显示，与对照相比，编辑株系中BR信号正调控因子BRI1、BZR1、ILI1和PRE1的转录本水平上调，而BR生物合成基因呈现阶段特异性调节：DWARF-4在所有阶段均上调，BR6OX在第二叶期上调，而CPD1和DET2保持稳定或略有下调。这表明TdIBH1功能丧失导致了BR信号输出的增强和BR合成的选择性反馈重塑。
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  编辑株系的内源BR定量分析：BR代谢物定量分析显示，编辑株系中并非所有BR中间体均增加。早期中间体（如campestanol, CR）无显著差异，而6-deoxotyphasterol（6-deoxoTY）在I35-3株系中积累增加，6-oxocampestanol（6-oxoCN）在I40-1株系中显著升高。相反，typhasterol（TY）在所有编辑株系中均显著降低。这进一步证实了BR代谢的选择性重塑，而非整体水平的提升。
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  编辑株系的表型特征：表型评价揭示了编辑株系与对照间一致的株型差异。编辑株系表现出显著的节间伸长、株高增加和旗叶角度增大（最大达131°，对照为23°）。生殖性状如育性和发芽率未受影响。关键的是，编辑株系的籽粒长度、宽度和千粒重（TGW）均显著增加，而单株种子数未减少，表明在不牺牲数量的前提下实现了籽粒增重。

讨论与结论

讨论部分指出，TdIBH1敲除产生的表型与增强BR信号输出一致，这与减弱BR感知（如BRI1突变）导致的矮化、直立叶表型形成鲜明对比，凸显了BR通路不同干预点可产生相反的株型效果。转录和代谢谱共同支持了一个模型：TdIBH1功能丧失解除了其对下游正调控因子的抑制，增强了BR信号输出，并通过反馈机制触发了BR合成途径的选择性重塑，以避免激素过量。这种精细调节避免了全局性BR水平升高可能带来的负面影响。

研究结论总结如下：CRISPR-Cas9介导的TdIBH1敲除支持了该转录因子作为硬粒小麦中BR介导生长的负调控因子的作用。TdIBH1功能丧失与增强BR信号的转录变化及BR代谢的选择性重塑相关联，导致了生物合成中间体的差异性积累而非活性激素水平的统一升高。这些分子和代谢变化伴随着株型的改变、籽粒尺寸和千粒重的增加。从应用角度看，这些发现将TdIBH1确定为未来育种和基因组编辑策略中用于修饰小麦株型和籽粒相关性状的潜在靶点。然而，其农艺价值仍需在大田条件和不同遗传背景下进行验证。