《Science of The Total Environment》：Effects of pig slurry fertilization history on grassland microbiomes: Insights from field and mesocosm experiments
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长期施用猪粪（pig slurry, PS）会在土壤及植物相关微生物群落中产生遗留效应（legacy effects）。根际微生物群落组成对施肥响应最为敏感。不同营养级间存在重叠属，提示微生物组变化可能沿营养链传播。施肥诱导的养分变化有利于富营养型（copio
长期施用猪粪（pig slurry, PS）会在土壤及植物相关微生物群落中产生遗留效应（legacy effects）。根际微生物群落组成对施肥响应最为敏感。不同营养级间存在重叠属，提示微生物组变化可能沿营养链传播。施肥诱导的养分变化有利于富营养型（copiotrophic）微生物，从而驱动群落更替。实验室尺度的中宇宙（mesocosm）实验能够再现自然草地生态系统中观察到的土壤-根系互作关系。
研究背景与问题：农业草地主要通过提供干草和青贮饲料来支撑畜牧业，其生产力与施肥强度密切相关。有机肥料通常被认为比无机肥料更具可持续性，但动物粪肥等有机肥会显著改变土壤pH和养分组成，进而影响微生物群落结构。此外，有机肥本身携带的微生物群及抗菌素抗性基因可能对微生物网络复杂性和功能产生潜在影响。长期施肥管理会造成土壤微生物多样性降低和群落组成重塑，即遗留效应；同时，短期施肥事件也会在数天内快速影响微生物多样性。然而，以往研究多聚焦于单一隔室（如土壤或根系），忽略了营养级间的关联性，而跨隔室的微生物交换对生态系统功能和宿主健康至关重要。因此，研究人员在前期发现猪粪施肥显著影响跨营养级微生物群落的基础上，进一步结合田间采样与受控中宇宙实验，旨在区分单次施肥事件的短期效应与反复施用猪粪的累积效应，并探究施肥历史如何调控这些响应，以及中宇宙系统能否有效模拟田间施肥效应。
研究内容与结论：研究人员在德国施瓦本阿尔卑斯地区的长期施肥管理草地上采集了土壤、根际、根内、花、熊蜂（Bombus lapidarius）等样品，并在实验室建立了两个连续的中宇宙实验（meso1和meso2），分别代表无施肥历史和有限施肥历史（meso2使用meso1处理过的土壤）。所有样品在施肥和刈割事件前后两个时间点（TP1和TP2）采集，最终共获得705个样品。通过16S rRNA基因V4区扩增子测序，分析了微生物群的alpha多样性、beta多样性、核心微生物组组成和差异丰度，并结合土壤养分含量分析，探究施肥影响的潜在机制。研究发现：长期施肥遗留效应在土壤和所有植物隔室中均显著重塑了微生物群落组成，其影响强度超过短期单次施肥；根际微生物群落在单次施肥后即有即时响应，且长期施肥显著降低了根际微生物多样性；中宇宙实验中，meso1（单次施肥）仅对根际和部分植物相关隔室产生显著影响，而meso2（重复施肥）则能在土壤中重现类似田间长期施肥的群落变化；核心微生物组中与植物健康相关的属（如Rhizobium、Pseudomonas、Novosphingobium）在施肥处理下保持稳定，但长期施肥导致富营养型类群（如Streptomyces、Pseudonocardia、Mycobacterium）丰度增加，同时减少Sphingomonas等病原防御相关类群；差异丰度分析以及与外源猪粪微生物组的比较表明，观察到的群落变化主要源于施肥导致的土壤养分（尤其是P、NO3、Fe）组成变化，而非施入的猪粪微生物在环境中定殖；跨营养级隔室间存在核心属重叠（如Gaiella在蚯蚓和根际之间，Snodgrassella、Lactobacillus、Gilliamella在熊蜂肠道和花之间），且相似的变化趋势沿营养链传播，支持生态全息生物（eco-holobiont）概念。该研究发表在《Science of The Total Environment》，揭示了长期施肥历史对单次施肥短期效应的调控作用，并证明复杂中宇宙系统可用于模拟和预测草地生态系统在人为干扰下的微生物响应，为可持续土地管理和生态全息生物系统研究提供了重要方法学支撑。
关键技术方法：研究人员从德国巴登-符腾堡州施瓦本阿尔卑斯山的农业草地采集土壤及多种营养级样品，其中对照组来自生物多样性探索框架（Biodiversity Exploratories）的未施肥草地（由羊群低强度放牧），猪粪处理组为当地农民合作选择的长期施猪粪草地（20年管理历史）。同时，在乌尔姆大学实验室建立两个连续中宇宙实验：meso1使用未施肥土壤并引入红三叶草（Trifolium pratense）、禾本科植物及蚯蚓（Lumbricus terrestris）和熊蜂（Bombus terrestris）；meso2使用meso1处理过的土壤，进一步种植红三叶草并施加猪粪。研究主要运用16S rRNA基因V4区扩增子测序（Illumina MiSeq平台，DADA2流程）分析微生物群落；基于Shannon指数和Bray-Curtis距离分别评估alpha和beta多样性，并用线性混合效应模型和PERMANOVA检验差异；通过核心微生物组分析（微生态学方法）和ANCOMBC2进行差异丰度分析；利用冗余分析（RDA）评估土壤养分（电超滤法测定）对群落组成的影响。
研究结果：
1. 长期猪粪施肥历史影响微生物群落多样性：田间样品的土壤和花微生物在对照区TP2时Shannon多样性显著高于TP1；长期施肥的根际样品在TP1时多样性显著低于对照，而中宇宙实验中未观察到施肥导致的显著多样性变化。结果表明长期施肥的遗留效应主要降低了根际微生物多样性，且中宇宙meso2的多样性模式与田间相似，提示重复施肥可部分模拟长期历史效应。
2. 长期施肥历史及短期猪粪施用影响微生物群落组成：基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA显示，田间土壤、根际、根内和花微生物组成均受施肥和采样时间点显著影响，且存在交互作用；熊蜂仅受采样时间影响。中宇宙meso1中，土壤微生物组成不受单次施肥影响，但根际和根内受施肥和时间点共同影响；在meso2中，重复施肥使土壤微生物组成也发生显著变化，根际和根内仍受显著影响。说明长期施肥历史对土壤和植物隔室微生物组成的塑造作用强于短期事件，而根际微生物对短期施肥最为敏感。
3. 核心微生物组在施肥历史中重叠：每个隔室的核心属在田间和中宇宙样品间以及不同营养级间存在明显重叠。根际和根内共享Rhizobium、Pseudomonas、Novosphingobium等促生菌；花的核心属在不同数据集中差异较大，但meso2和田间PS样品的TP2共享Gaiella、Microvirga、Mycobacterium；熊蜂肠道核心属Snodgrassella、Lactobacillus、Gilliamella在meso1中与花核心属重叠；蚯蚓与土壤、根际在Gaiella等属上重叠。表明核心微生物组相对稳定，施肥史并未显著改变核心成员构成。
4. 施肥历史决定短期猪粪施用的差异丰度效应，但猪粪相关类群未定殖：ANCOMBC2差异丰度分析显示，田间样品中差异丰度属的数量最多；长期施肥田间样品中，Streptomyces在根际和根内丰度升高，Bacillus降低；Pseudonocardia和Mycobacterium在土壤中显著富集；meso1中Sphingomonas和Pseudomonas在根际PS处理中丰度降低。将差异属与猪粪自身微生物组比较，未发现猪粪来源菌群在隔室中丰度增加，说明群落变化并非由外源菌定殖引起，而是由核心成员丰度调整所致。
5. 土壤养分对土壤微生物组成有贡献：冗余分析显示，土壤养分变量共解释56.1%的微生物组成变异，其中P、NO3和Fe影响最显著；大量元素（N、NO3、P、K、Ca、Mg、B、S）单独解释40.10%，微量元素（Fe、Na、Mn、Zn）解释26.46%。中宇宙meso1与田间对照土壤的养分含量大体可比，表明施肥引起的养分变化（特别是P、NO3、Fe）驱动了土壤微生物群落组成变化，属于间接效应。
讨论与结论：讨论部分指出，长期施肥史对土壤和植物微生物群落的塑造作用大于短期单次施肥；单次施肥仅引起根际群落的即时变化，而土壤群落对短期扰动具有韧性。蚯蚓和花微生物的短期变化可能通过摄食和微生物转运等营养级互作传播；核心微生物组中促生菌的稳定性保障了植物健康，而富营养型类群的扩增和病原防御类群的减少构成长期施肥的遗留风险。研究结论认为，长期施肥在土壤和植物相关微生物群落中产生遗留效应，其机制是养分变化驱动群落组成改变，而非施肥带入的微生物定殖；营养级间重叠属和相似变化支持生态全息生物概念；中宇宙系统通过重复施肥能够再现田间长期遗留效应，为未来研究复杂生态互作提供了有效平台。
