基于细胞系的高效gRNA验证方法用于Cas9基因组编辑

《Scientific Reports》：An optimized pipeline for cell-based validation of gRNAs designs to inactivate coding and non-coding RNAs using CRISPR-Cas9

摘要

基于细菌 Cas9 蛋白的基因组编辑技术已成为在多个物种和实验模型中引入精确遗传修饰的金标准。这些工具需要设计和验证向导 RNA（gRNAs），以引导 Cas9 蛋白到实际要编辑的基因组位置。尽管已经开发了多种算法来设计 gRNA，但某个 gRNA 是否有效仍需通过实验进行评估。由于大多数时候会并行测试多种设计，我们建立了一种高效的基于细胞的方法，通过直接量化 gRNA 对下游目标 RNA 或蛋白的影响来优化此验证过程。我们的策略依赖于：(1) 创建表达目标基因和荧光报告基因的稳定细胞系；(2) 用不同的 gRNA 对这些细胞系进行瞬时转染；(3) 在全群体或经 FACS 分选的细胞中分析这些设计在转录组水平和/或蛋白水平上的效率。我们通过失活一个编码基因（Elk1）和两个短非编码 RNA（miR-218 和 miR-124）来展示我们方法的相关性。