《Cells》：Disease- and Region-Specific Molecular Patterns Involving miRNAs and Associated Signalling Pathways and Epithelial Cell-Fate Responses in PSC-Associated Ulcerative Colitis
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原发性硬化性胆管炎相关性溃疡性结肠炎（primary sclerosing cholangitis-associated ulcerative colitis, PSC-UC）患者较普通溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）患者的结直肠癌
原发性硬化性胆管炎相关性溃疡性结肠炎（primary sclerosing cholangitis-associated ulcerative colitis, PSC-UC）患者较普通溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）患者的结直肠癌风险更高，但慢性炎症与上皮细胞命运之间的分子机制尚不明确。本研究探讨了涉及miRNA及相关PI3K/AKT、STAT3和NF-κB信号通路的疾病及区域特异性分子模式。研究人员分析了PSC、PSC-UC、UC患者及对照组的配对升结肠和乙状结肠活检组织中miR-21、miR-181a、miR-181b及关键通路组分的表达。在HT-29和NCM460D细胞中检测了功能性效应，并对包括miR-155在内的循环miRNA进行了评估。UC的特征是miR-181a显著上调和PI3K/AKT激活，而PSC-UC表现为PDCD4降低、p65调控差异以及miR-181a/miR-181b协调性改变。在NCM460D细胞中，miR-181a和miR-181b降低了细胞活力、促进了凋亡、损害了细胞周期进程，并减少了PDCD4、p-AKT和p-STAT3的表达；miR-181b还额外降低了CYLD。与UC相比，PSC-UC患者血清miR-155升高，并表现出最强的个体鉴别能力。随机森林分析和探索性多变量血清miRNA谱显示出鉴别潜力。这些发现支持PSC-UC中存在涉及miRNA及相关信号通路的疾病和区域特异性分子模式，并与上皮细胞命运应答相关联，同时突出了PSC-UC与普通UC之间的分子差异。
研究背景
原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis, PSC）是一种慢性胆汁淤积性肝病，常与炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）特别是溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）密切相关。PSC相关性UC（PSC-UC）是一种独特的临床实体，其特征为广泛的、常呈右侧结肠炎表现，并且相较于单纯UC，其结直肠肿瘤发生风险显著升高。尽管慢性肠道炎症被认为可通过控制上皮增殖、凋亡、免疫应答、基因组稳定性和代谢等相互关联的通路促进癌变，其中PI3K/AKT、STAT3和NF-κB是将炎症与上皮细胞命运及恶性转化联系起来的主要信号枢纽，但在PSC-UC中，这些microRNA（miRNA）及其相关通路是否独立失调或经历协调的、区域特异性的重塑仍不清楚。因此，研究人员假设PSC-UC的特征在于涉及miRNA和相关信号通路的疾病及肠道定位特异性分子改变，这些改变可能有助于上皮细胞命运应答。
研究方法
研究人员共纳入62名受试者，包括22名对照组、12名孤立性PSC患者、18名PSC-UC患者和10名普通UC患者。结肠活检组织取自升结肠和乙状结肠的解剖匹配位点。采用实时定量PCR（RT-qPCR）检测组织和血清中miRNA（miR-21、miR-155、miR-181a、miR-181b）及mRNA（PTEN、STAT3、RELA/p65、CYLD）的表达。通过Western blot检测蛋白（p-AKT、PDCD4、CYLD、p-STAT3）表达水平。利用免疫组化（IHC）对p-STAT3、p-AKT、p-ERK1/2和Ki-67进行定性可视化及空间定位。在体外功能研究中，分别用miR-21模拟物转染HT-29细胞，用miR-181a或miR-181b模拟物转染非转化NCM460D结肠上皮细胞，随后分析细胞活力、凋亡、细胞周期分布及蛋白表达。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）、Kruskal-Wallis检验、重复测量一般线性模型（GLM）、Spearman秩相关、主成分分析（PCA）、随机森林算法及受试者工作特征（ROC）曲线分析。
研究结果
3.1 升结肠和乙状结肠中miR-21、miR-181a和miR-181b的表达
在升结肠中，UC患者的miR-21表达显著高于对照组和PSC-UC组；而在乙状结肠中各组间无显著差异。UC患者在升结肠和乙状结肠中的miR-181a表达均显著高于对照组、PSC组和PSC-UC组。miR-181b仅在乙状结肠中显示UC组显著高于对照组。
3.2 升结肠和乙状结肠中CYLD和p65 mRNA的表达
在升结肠中，UC患者的CYLD mRNA表达显著高于对照组和PSC组。PSC-UC患者的p65 mRNA在升结肠中显著高于对照组和PSC组，而在乙状结肠中则显著低于对照组；此外，PSC组在乙状结肠中的p65 mRNA显著高于其他所有组。
3.3 蛋白表达
在升结肠和乙状结肠中，UC患者的p-AKT蛋白均显著高于对照组和PSC-UC组。PSC-UC患者在升结肠中的PDCD4蛋白显著低于对照组，而UC患者则显著高于对照组和PSC-UC组；在乙状结肠中，UC患者的PDCD4也显著高于其他组。PSC患者在升结肠中的CYLD蛋白显著高于对照组和PSC-UC组；在乙状结肠中，PSC-UC患者的CYLD显著高于UC患者。在升结肠中，所有患者组（PSC、PSC-UC、UC）的p-STAT3蛋白均显著高于对照组；在乙状结肠中，仅UC组显著高于对照组。
3.4 疾病和肠道定位效应（GLM）
疾病状态显著影响多个标志物，其中p-AKT蛋白、miR-181a和PDCD4蛋白的效应最大。肠道定位效应对miR-21、miR-181a、PTEN、STAT3、p65和p-STAT3有显著影响，而疾病与定位的交互作用对miR-181a、PTEN、STAT3、p65和p-STAT3显著。
3.5 相关性分析
在乙状结肠中，PSC组呈现PTEN-STAT3和STAT3-CYLD正相关；PSC-UC组呈现miR-21-p65正相关和miR-181a-miR-181b负相关；UC组呈现miR-181a-miR-181b正相关。
3.6 主成分分析
PCA显示PSC-UC与UC两组在升结肠和乙状结肠中均有大量重叠，未观察到明确的分子分离。
3.7 机器学习
随机森林分析显示，在区分PSC-UC与UC时，升结肠的平均交叉验证AUC为0.943（准确率0.825），乙状结肠为0.825（准确率0.756）。升结肠中最重要的变量为CYLD mRNA、PTEN mRNA、miR-181a和p-AKT；乙状结肠中则为p65 mRNA、miR-21、miR-181a和PTEN mRNA。
3.8 循环miRNA区分PSC-UC与UC的性能
血清miR-155在PSC-UC组中显著高于UC组，且作为单个循环miRNA表现出最高的区分性能（AUC=0.797）。探索性多变量血清miRNA谱（包含miR-21、miR-155、miR-181a、miR-181b）在完整病例子集中显示出表观AUC为1.000，但需谨慎解读。
3.9 选定miRNA的体外功能效应
在HT-29细胞中过表达miR-21未显著影响细胞活力、凋亡、细胞周期及所测蛋白。在NCM460D细胞中，过表达miR-181a或miR-181b均显著降低细胞活力、增加晚期凋亡、减少S期细胞比例。miR-181b显著降低CYLD蛋白。两者均显著降低PDCD4、p-AKT和p-STAT3蛋白表达。
3.10 信号通路标志物的免疫组化定位
p-AKT免疫反应性主要位于黏膜上皮区室。p-STAT3核染色主要见于固有层炎症细胞，上皮细胞核染色弱或无。p-ERK和Ki-67染色提供了生长相关信号和上皮增殖活性的定性空间背景。
讨论与结论
该研究证实PSC-UC和普通UC存在涉及miRNA及相关信号通路的、依赖于疾病和肠道区域的独特分子模式。UC的特征是miR-181a显著上调和PI3K/AKT激活，而PSC-UC则表现为PDCD4降低、p65调控差异以及miR-181a/miR-181b协调性改变。miR-181a和miR-181b的功能扰动可改变细胞活力、凋亡、细胞周期进程以及PDCD4、p-AKT和p-STAT3的表达。此外，miR-181b过表达可降低NCM460D细胞中的CYLD，进一步证明miR-181扰动能够修饰与上皮细胞命运相关的信号应答。
结合研究人员先前关于miR-346、miR-506、miR-155和miR-125b等miRNA的研究，这些发现支持PSC-UC中存在一个整合的、依赖于环境和区域的分子改变模型，该模型与炎症相关的结直肠癌发生有关，涉及上皮防御、炎症信号传导、基因组维护、胆汁酸应答、鞘脂代谢和细胞命运调控等多个过程。
