固态发酵啤酒糟（BSG）强化饼干改善蛋白质组成但未增强代谢综合征（MetS）个体餐后氨基酸血症：一项随机双盲交叉试验

《Foods》：Protein Composition and Postprandial Aminoacidemia of Biscuits Fortified with Brewer’s Spent Grain and Fermented Brewer’s Spent Grain in Individuals with Metabolic Syndrome

　　

啤酒糟（Brewer’s spent grain, BSG）是啤酒酿造的主要副产物，是一种丰富且低成本的植物蛋白来源，但其消化率有限。发酵预处理可能通过改变氨基酸组成和提高蛋白质可及性来改善蛋白质质量。本研究探讨了使用少孢根霉（Rhizopus oligosporus）对BSG进行固态发酵是否可改善氨基酸组成，并在代谢综合征（MetS）成人摄入含BSG饼干后进一步引起更高的餐后氨基酸反应。制备了对照饼干（100%小麦粉）以及用30%加压灭菌BSG和发酵BSG替代的饼干。通过分析总氨基酸和游离氨基酸，以及根据成人必需氨基酸需要量计算的氨基酸评分，评估组成改善。随后，15名MetS成人在随机、双盲、交叉试验中摄入90 g每种饼干，并在120 min内评估餐后血浆氨基酸。加入BSG增加了饼干中总氨基酸含量，而发酵进一步增加了游离氨基酸含量。赖氨酸氨基酸评分也从0.57（对照）增加至0.81（发酵BSG）。尽管有这些组成改善，餐后总氨基酸和必需氨基酸反应在饼干之间无差异，表明在MetS个体中，蛋白质组成改善与餐后氨基酸反应之间存在脱节。

【研究背景】啤酒糟（Brewer’s spent grain, BSG；啤酒酿造过程中产生的主要副产物）是啤酒糖化后产生的主要侧流，约每100 L啤酒可产生20 kg BSG。其主要由大麦谷壳及较少比例的果皮和胚乳层组成，含约70%木质纤维素、约20%粗蛋白以及酚类化合物等生物活性成分，因此被视为低成本、丰富、具有未开发营养潜力的食品级副产物。将BSG掺入食品受到关注，因为其可减少食物浪费，并促进可持续的替代植物蛋白来源。从营养角度看，BSG蛋白含量低于大豆（33–50%），但与豌豆和蚕豆（16–29%）等其他替代植物蛋白来源相当。蛋白质质量不仅取决于总蛋白含量，还受氨基酸组成、消化率和餐后必需氨基酸生物利用度影响。与多数谷物蛋白相比，BSG含有相对较高的赖氨酸，而赖氨酸通常是多数植物性饮食中的限制性氨基酸；Pérez-Alva et al.指出BSG赖氨酸含量可高达小麦粉的3–4倍。然而，BSG蛋白消化率仍受大麦醇溶蛋白（hordeins）丰富、抗营养因子以及顽固细胞结构限制。啤酒酿造糖化后残留的多数蛋白形成增强的二硫键交联和聚集，难以分解。因此，若不预处理，BSG中营养有价值的氨基酸的消化率和有效利用可能受限。固态发酵（solid-state fermentation；在低水活度固体基质上进行的微生物发酵）使用丝状真菌如少孢根霉（Rhizopus oligosporus, RO）已受到关注，可提高BSG的可溶性纤维、氮和游离氨基酸含量，并降低抗营养因子，提示发酵可能改善蛋白质质量和营养素可利用性。但多数评估发酵BSG的研究主要关注组成变化或体外蛋白消化率，这些改善是否转化为人体生理益处尚未明确。在人体中，膳食蛋白营养价值最终取决于消化过程中氨基酸释放、肠上皮吸收以及进入体循环供代谢利用的程度。餐后血浆氨基酸反应（postprandial plasma amino acid response, PPAR）虽不能在无示踪剂时直接测定绝对外源可利用性，但反应幅度可表征不同食物来源氨基酸摄入后随时间出现在循环中的情况，确认膳食蛋白已被消化和吸收。由于MetS的饮食管理常鼓励增加植物来源蛋白摄入，评估BSG等新兴植物蛋白来源的氨基酸代谢可利用性对该人群尤其重要。研究人员假设，BSG发酵会增加蛋白质可及性和游离氨基酸含量，从而在MetS个体中引起比未发酵BSG饼干更大的餐后血浆氨基酸反应。

【研究开展与意义】研究人员首先评估以加压灭菌BSG或RO发酵BSG部分替代小麦饼干的氨基酸组成变化，随后评估MetS个体摄入饼干后的PPAR。研究结论是：发酵可改善BSG氨基酸组成，尤其提高赖氨酸氨基酸评分和游离氨基酸含量；但在所研究的现实替代剂量下，这些组成改善未在MetS个体早期0–120 min餐后期间产生可检测的系统氨基酸暴露差异。其意义在于，BSG发酵仍是将其升级循环为更具营养优势成分的有前景手段，但蛋白组成改善与人体餐后氨基酸反应之间可能存在脱节，未来需结合互补氨基酸组成混合、更长餐后采样期或不同健康状态人群进一步理解。

【关键技术方法概述】BSG来自Brewerkz Brewing Co. (Singapore)。研究人员制备对照饼干、30%加压灭菌BSG饼干（ABSG）和30%发酵BSG饼干（FBSG），并采用氨基酸分析仪测定总氨基酸（total amino acid, TAA）和游离氨基酸（free amino acid, FAA），计算氨基酸评分（amino acid score, AAS）。临床研究经NUS-IRB-2022-089批准并注册于clinicaltrials.gov（NCT05421780），纳入15名完成研究的MetS成人，采用随机、双盲、交叉试验，摄入90 g饼干后120 min内评估PPAR；统计分析使用线性混合模型（linear mixed model, LMM）、梯形法则计算增量曲线下面积（incremental area under the curve, iAUC）、C_max和T_max，并以Wood曲线进行探索性分析。

【研究结果】
3.1 粉末和饼干中的氨基酸谱（Amino Acid Profile in Powder and Biscuits）
通过氨基酸分析发现，发酵总体上增加FP-BSG中TAA和总必需氨基酸（total essential amino acid, TEAA），但未达显著。除蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、脯氨酸和酪氨酸显著降低，亮氨酸、缬氨酸和苏氨酸不显著增加外，其他氨基酸显著增加。饼干中，ABSG和FBSG较对照饼干显著提高TAA、TEAA及多种个体氨基酸，包括天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和精氨酸。FBSG较对照饼干还显著提高异亮氨酸和赖氨酸。总非必需氨基酸（total non-essential amino acid, TNEAA）在ABSG和FBSG中均显著高于对照，两种BSG饼干间无显著差异。脯氨酸仅在ABSG中显著高于对照，半胱氨酸在ABSG中显著低于FBSG。FBSG较ABSG和对照饼干显著提高总游离氨基酸（total free amino acid, TF-AA）、总游离必需氨基酸（total free essential amino acid, TF-EAA）和总游离20种蛋白源性氨基酸（TF-20AA）。此外，FBSG中检测到少量非蛋白源性游离氨基酸。结论是掺入BSG增加饼干总氨基酸，发酵进一步增加游离氨基酸。

3.2 饼干的氨基酸评分（AAS of Biscuits）
通过将必需氨基酸含量与联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization, FAO）成人必需氨基酸参考模式比较，计算AAS。结果显示，除赖氨酸外，所有必需氨基酸的AAS均超过FAO参考模式（AAS > 1.0），ABSG和FBSG通常高于对照饼干。赖氨酸AAS从对照饼干的0.57增加至ABSG的0.61和FBSG的0.81。

3.3 PPAR时间过程和动力学参数分析（Analysis of PPAR Time Course and Kinetic Parameters）
15名参与者完成研究，其中10名男性和5名女性，平均年龄63 ± 10岁。所有参与者至少符合5项MetS标准中的3项，6名符合4项，1名符合全部5项。对P-T₂₁AA和血浆必需氨基酸（plasma essential amino acid, P-EAA）的PPAR分析显示，原始浓度和按饼干TAA归一化后均存在显著时间效应，但无显著时间×干预交互效应。血浆非必需氨基酸（plasma non-essential amino acid, P-NEAA）和个体氨基酸曲线中，仅半胱氨酸出现显著交互效应。动力学分析中，原始PPAR浓度下，P-T₂₁AA、P-EAA或任何个体氨基酸的动力学参数均无显著组间差异，唯一例外是P-NEAA的T_max在FBSG中显著低于ABSG。归一化后，P-T₂₁AA和P-EAA亦无显著差异。少数个体氨基酸在归一化后出现显著差异，如谷氨酰胺净iAUC在对照中显著高于ABSG，脯氨酸净iAUC和正iAUC在对照中显著高于两种BSG饼干；但这些差异经Benjamini–Hochberg错误发现率（false discovery rate, FDR）校正后均不显著。Wood曲线分析所得参数与传统梯形估计大致相似，P-T₂₁AA或P-EAA无显著差异，但仅61%的Wood曲线成功拟合，因此结果更具探索性。

【讨论总结】烘焙产品消费广泛，但通常为碳水化合物密集、蛋白含量和质量有限的食品。掺入BSG等替代蛋白丰富成分可改善营养 profile，并促进可持续健康饮食。本研究中，BSG掺入显著增加饼干TAA和FAA，发酵进一步改善蛋白质组成，尤其提高赖氨酸AAS。然而，尽管必需氨基酸谱和蛋白含量改善，未转化为MetS个体PPAR的显著改善。精制小麦粉蛋白质量低，缺乏赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸；BSG蛋白含量较高，可解释氨基酸含量增加。发酵通常可通过真菌生物量积累、胞外酶分泌、非淀粉多糖降解导致干质量减少以及真菌蛋白酶分解储存蛋白为小肽和FAA，增加蛋白和氨基酸含量。本研究中，发酵未在粉末或饼干水平显著增加TAA和EAA，可能因RO不能固氮，依赖底物氮进行真菌蛋白合成，且不同研究间菌株、条件和时间差异。发酵使氨基酸谱更有利，真菌利用脯氨酸和谷氨酸，并相对增加赖氨酸。Sun et al.显示RO发酵豆粕后必需氨基酸代谢物增加。Hoehnel et al.使用荞麦、蚕豆和羽扇豆组合将意大利面AAS从0.57提高至0.87，赖氨酸为限制氨基酸；本研究表明发酵可作为单一成分替代混合来改善AAS。发酵还增加非蛋白源性氨基酸，包括γ-氨基丁酸，可能是真菌生长代谢副产物，但其生理意义尚不明确。发酵通常改善蛋白消化率，机制包括蛋白结构修饰、溶解度增加、降解为小肽、抗营养因子降低以及真菌细胞壁更易消化。Wang et al.使用改良INFOGEST消化模型显示RO可食用丝状真菌的水解度和氨基酸可及性与鲑鱼、鸡肉和牛肉肌肉蛋白相似。但体外消化模型不能完全复制人体消化，因此本研究在体内测定PPAR。尽管有理论益处，PPAR曲线、达峰时间和iAUC多数无显著差异，这与近期系统综述和meta分析一致，即加工诱导的体外蛋白消化率改善未一致反映在体内餐后氨基酸反应。绝对蛋白剂量可能部分解释：Perez-Moral et al.报道鹰嘴豆细胞富集面包较白面包PPAR更高，其每干预提供17–26 g蛋白，而本研究为9–11 g；Lee et al.发酵豆渣饼干与普通小麦饼干PPAR无显著差异，蛋白约7–8 g，提示适度蛋白剂量可能不足以产生可检测的系统氨基酸出现差异。BSG基质结构可能限制蛋白可及性：全BSG富含纤维和木质纤维素细胞壁，可包裹蛋白，限制酶可及性，减慢蛋白水解和胃排空，减弱早期PPAR。Canedo, de Paula, da Silva and Vendruscolo指出RO孢子可固定于BSG表面生长而不破坏结构，可能限制蛋白可及性改善。BSG蛋白分离物也可能因交联和折叠对蛋白水解敏感性较低。生理因素方面，首过内脏提取随年龄增加，参与者平均63岁，更多吸收氨基酸可能经肝摄取或氧化而不改变系统出现；MetS中胰岛素抵抗和空腹支链及芳香族氨基酸升高可能掩盖较小差异，Yanni et al.观察到超重成人对相同植物蛋白富集饼干血浆iAUC低于正常体重成人。研究优势包括全面评估蛋白组成和摄入BSG食品后的PPAR，而非提取补充剂，允许在现实混合餐烘焙基质中评估氨基酸动力学，并在可能受益于改善蛋白质量饮食策略的MetS人群中进行。局限包括：标准饼干服务中蛋白剂量仍适度，更高剂量需超出可接受感官和物理性质的替代水平；PPAR为次要结局，统计功效有限；更长餐后时间可能必要，植物蛋白PPAR增加较小且延迟，老年人群更延迟，支链氨基酸可在餐后6–8 h出现二次升高；缺乏健康对照组，限制区分观察到的氨基酸反应主要受BSG干预还是MetS代谢特征影响。

【研究结论翻译】总之，这些发现表明，发酵可改善BSG的氨基酸组成，特别是增加赖氨酸氨基酸评分和游离氨基酸含量。然而，在所研究的现实替代剂量下，这些组成改善未导致MetS个体在早期0–120 min餐后期间系统氨基酸暴露的可检测差异。虽然BSG发酵仍是通过升级循环将其转化为更具营养有利性的成分的有前景手段，但未来研究纳入具有互补氨基酸组成的混合干预、更长餐后采样期或不同健康状况人群，可提供对其对PPAR影响的更全面理解。