《Foods》：Newly Isolated Kluyveromyces marxianus Strain Capable of Producing Oleic Acid-Rich Oil for Human Consumption from Whey
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奶酪乳清（cheese whey）是一种广泛可得的农业食品副产物，其高有机负荷给乳品工业与环境管理带来了重大挑战。鉴于传统植物油生产相关的环境问题，将其生物转化为高价值、可持续的功能性脂质日益重要。本研究考察了一株能够利用奶酪乳清合成富含油酸油脂的野生型酵母菌
奶酪乳清（cheese whey）是一种广泛可得的农业食品副产物，其高有机负荷给乳品工业与环境管理带来了重大挑战。鉴于传统植物油生产相关的环境问题，将其生物转化为高价值、可持续的功能性脂质日益重要。本研究考察了一株能够利用奶酪乳清合成富含油酸油脂的野生型酵母菌株的分离、鉴定和表征。研究人员对六个不同来源进行筛选，获得13株能够在乳清乳糖上生长的微生物分离株，其中5株表现出中性脂质（neutral lipids）积累。选择脂质含量最高的分离株，经分子鉴定为Kluyveromyces marxianus CM3b。在基于乳清的培养基中对K. marxianus CM3b进行分批培养（batch cultivation），24 h时达到最大生物量浓度5.50 ± 0.06 g/L和脂质浓度2.68 ± 0.08 g/L，对应的脂质产量（lipid yield）为0.49 ± 0.02 g/g生物量（约49% w/w），24 h体积脂质生产率（volumetric lipid productivity）为2.68 ± 0.08 g/L·d。提取的油脂含有高比例的单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids, MUFAs，69.56%），其中主要为油酸（oleic acid, C18:1，53.51%），其脂肪酸组成与牛油果油和橄榄油相当。这些发现凸显K. marxianus CM3b是一株有前景的野生型菌株，可用于从基于乳清的底物中可持续生产富含油酸的微生物油。然而，仍需进一步的理化表征和菌株特异性安全评估，以确定其在食品应用中的适用性。
**研究背景与问题**
乳制品工业产生大量乳清副产物，约占加工牛奶体积的85%–90%，全球年产量约1.62亿吨。乳清中乳糖含量高，导致化学需氧量达60,000–80,000 mg/L、生化需氧量达30,000–50,000 mg/L，未经处理排放会造成严重环境污染。但乳清同时富含乳糖、可溶性蛋白质、维生素和矿物质，是微生物生物转化（biovalorization）为高价值化合物的优良底物。与此同时，食品和营养品行业对可持续脂质来源的需求日益增长，单不饱和脂肪酸（MUFAs），尤其是油酸（C18:1 ω-9），因有益心血管、免疫和代谢健康而备受关注。产油微生物（oleaginous microorganisms）可积累超过20%干重的胞内中性脂质，其脂肪酸组成与植物油相似，且能利用低成本副产物，因此被认为是传统油脂的替代来源。然而，目前缺乏既能利用乳清乳糖又能高效产油的野生型食品级酵母菌株，也缺少整合细胞生长、乳糖消耗、产脂动力学和脂肪酸组成的系统数据。为此，研究人员开展了本研究，旨在分离和鉴定一株能将乳清底物转化为微生物油的野生型产油微生物，并评估其生长动力学、脂质积累规律和脂肪酸组成，以探索其在食品相关领域的应用潜力。
**主要技术方法**
研究人员从变质乳制品、变质乳制品副产物和农场土壤等六个来源采集样品，以复原甜乳清粉（F & A Dairy Products, Inc.）配制的乳清培养基进行约30天的分批富集培养，分离纯化后采用Oil Red O染色筛选产油菌株，并通过MALDI-TOF MS蛋白质组学初步鉴定。随后对优选菌株扩增16S-ITS1-5.8S-ITS2-26S rDNA区域并测序，构建邻接法系统发育树进行分子鉴定。在摇瓶中开展非优化分批发酵，定时测定生物量、乳糖和脂质浓度，采用Folch法提取油脂，经甲酯化后用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析脂肪酸组成。统计采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验。
**研究结果**
**3.1 能利用乳清生长并产脂的微生物分离株的分离、筛选、蛋白质组鉴定与选择**
通过分批富集培养，从六个来源获得13株能在乳清乳糖上生长的微生物分离株，其中5株（CM1a、CM2a、CM3a、CM3b、CM5a）经Oil Red O染色呈阳性，初步鉴定为Candida krusei（两株）、Candida tropicalis、Candida kefyr和Pichia fabianii。定量评估显示，C. kefyr CM3b在发酵24 h时脂质含量最高，达50.03% ± 2.96%（w/w），而其他产油菌株需48 h才能达到峰值。鉴于C. krusei和C. tropicalis为机会性病原体，且C. kefyr是K. marxianus的无性型，而K. marxianus具有食品发酵应用史，研究人员选择CM3b作进一步研究。
**3.2 酵母分离株CM3b的分子鉴定**
通过扩增16S-ITS1-5.8S-ITS2-26S rDNA区域并测序，获得694个核苷酸的序列，与Kluyveromyces marxianus strain Rubing Y-13（GenBank登录号LC269188.1）的序列覆盖度和一致性均为100%；系统发育树也支持CM3b位于K. marxianus分支。由此将CM3b鉴定为K. marxianus。该物种具有欧洲食品安全局（EFSA）的“安全性资格认定”（QPS）和美国FDA的“一般认为安全”（GRAS）地位，并具备宽底物谱、耐热性、高生长速率、Crabtree阴性等工业优势。这是首次报道野生型K. marxianus菌株在热去蛋白乳清培养基中不经乳糖酶水解或基因改造而实现显著产脂。
**3.3 K. marxianus CM3b的细胞生长、乳糖消耗和脂质生产动力学**
非优化分批培养中，K. marxianus CM3b未呈现明显延迟期，指数生长期约16 h，24 h时达到最大生物量浓度5.50 ± 0.06 g/L、最大脂质浓度2.68 ± 0.08 g/L。脂质产量为0.49 ± 0.02 g/g生物量（约49% w/w），体积脂质生产率为2.68 ± 0.08 g/L·d，高于多种乳清培养酵母的报道值。脂质积累峰值出现在指数期向平稳期转变的24 h，其机制可能与氮限制和呼吸代谢有关，但本研究未评估氮消耗、乙醇生成或代谢通量。
**3.4 K. marxianus CM3b的脂肪酸组成**
在24 h时提取的油脂中，油酸（C18:1）为主要脂肪酸，占53.51%；其次为棕榈酸（C16:0，27.72%）、棕榈油酸（C16:1，16.05%）、硬脂酸（C18:0，1.53%）和肉豆蔻酸（C14:0，1.17%）。MUFAs占总脂肪酸的69.56%，饱和脂肪酸（SFAs）占30.42%，未检测到多不饱和脂肪酸（PUFAs）。油酸比例高于多种乳清培养酵母（如C. curvatus NRRL Y-1511的52.8%），且仅需24 h，显示培养时间优势；但脂肪酸合成相关酶活和代谢机制未在本研究中测定。
**3.5 脂肪酸生产力**
在最大脂质积累时间（24 h），油酸的体积生产力和特定生产力分别为59.75 ± 0.9 mg/L·h和11.27 ± 0.32 mg/g生物量·h，均高于文献报道的C. curvatus NRRL Y-1511、C. laurentii UCD 68-201和M. isabellina ATHUM 2935等菌株。棕榈酸次之，而硬脂酸和肉豆蔻酸的生产力较低。该高产油酸生产力进一步支持了K. marxianus CM3b的工业应用潜力。
**3.6 K. marxianus CM3b油与植物油脂肪酸组成的比较**
径向图分析显示，K. marxianus CM3b油的脂肪酸组成与牛油果油和橄榄油最接近，均为高油酸、中等棕榈酸；而大豆油、花生油和葵花油富含亚油酸（C18:2），棕榈油则含更多棕榈酸且MUFAs较低。这种组成相似性提示微生物油可能具有类似的价值，但尚需更多性质验证。
**讨论与结论**
讨论指出，脂肪酸组成本身不足以确定油脂的食品适用性，还需测定酸值、过氧化值、氧化稳定性和热性能，并进行感官评价和菌株特异性安全评估。本研究使用复原热去蛋白乳清，且培养在摇瓶非优化条件下进行，结果不能直接外推至未处理的工业乳清或规模化生物反应器。未来应评估实际工业乳清流、优化供氧和搅拌、pH及温度控制，并分析上下游成本。结论如下：一株新分离的野生型酵母菌株K. marxianus CM3b在非优化分批培养条件下，以热去蛋白乳清基培养基生产富含油酸的微生物油，24 h时脂质产量达49%（w/w），体积脂质生产率为2.68 g/L·d。所得油脂含53.51%油酸，与橄榄油和牛油果油组成相似。K. marxianus CM3b无需乳糖酶预水解即可利用乳清乳糖，且脂质积累快速、油酸含量高，支持其作为产油菌株进一步开发。鉴于K. marxianus在食品发酵中的既有应用，这些发现对研究微生物油在潜在食品应用中具有重要意义。然而，该菌株的安全性及其油脂是否适合人类食用仍待确定。
