《Cell Reports》：Mitochondrial transfer protects against cisplatin-induced hearing loss by fumarate-mediated activation of mitophagy
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感音神经性听力损失（Sensorineural hearing loss, SNHL）影响着全球数百万人，而铂类化疗药物被认为是其重要病因之一。本研究阐明了间充质干细胞（Mesenchymal stem/stromal cells, MSCs）在小鼠模型中通过
感音神经性听力损失（Sensorineural hearing loss, SNHL）影响着全球数百万人，而铂类化疗药物被认为是其重要病因之一。本研究阐明了间充质干细胞（Mesenchymal stem/stromal cells, MSCs）在小鼠模型中通过线粒体转移保护顺铂诱导的耳蜗损伤的机制。经全身给药的MSCs归巢至耳蜗，并通过隧道纳米管（Tunneling nanotubes, TNTs）将线粒体转移至受损的螺旋神经元（Spiral ganglion neurons, SGNs），导致三羧酸循环中间体富马酸盐（fumarate）的细胞内水平升高，从而激活线粒体自噬（mitophagy）以清除功能失调的线粒体。从机制上讲，富马酸二甲酯（Dimethyl fumarate, DMF）——一种临床可用的富马酸盐衍生物——共价修饰磷酸酶PPP1CB的第126位半胱氨酸，从而阻断PPP1CB介导的线粒体融合蛋白2（Mitofusin 2, MFN2）的去磷酸化，进而增强线粒体自噬，最终保护听觉功能。这些发现揭示了MSCs通过递送健康线粒体并促进受损线粒体的清除，在受损SGNs中协调完成线粒体替换，凸显了该策略在治疗与线粒体功能障碍相关的SNHL方面的治疗潜力。
一、研究背景与研究目的
感音神经性听力损失（Sensorineural hearing loss, SNHL）是全球最常见的听力障碍类型，通常由噪声暴露、衰老或耳毒性药物如顺铂（cisplatin）引起。顺铂为基础的化疗在40%-60%的肿瘤患者中导致不可逆的SNHL，严重限制其临床应用。尽管硫代硫酸钠已被FDA批准用于减轻儿童患者的顺铂耳毒性，但其适应症窄、剂量依赖性明显且在重症病例中疗效降低。因此，开发更有效的预防和治疗策略仍是紧迫的科学和临床需求。
顺铂进入耳蜗细胞后迅速在线粒体中蓄积，破坏线粒体功能，导致细胞死亡。线粒体自噬（mitophagy）是选择性清除受损线粒体的关键质量控制通路，其中线粒体融合蛋白2（Mitofusin 2, MFN2）作为PINK1-Parkin介导的线粒体自噬的重要调控因子，其功能受磷酸化等翻译后修饰调节。基于此，保护和恢复线粒体功能的策略成为预防顺铂耳毒性的有前景的治疗方向。
间充质干细胞（Mesenchymal stem/stromal cells, MSCs）因其归巢受损组织的能力和瞬时的“打就跑”（hit-and-run）效应而被广泛研究。近年研究发现MSCs可通过隧道纳米管（Tunneling nanotubes, TNTs）等方式向受损受体细胞捐赠功能性线粒体，从而恢复细胞生物能量学并改善线粒体质量控制。然而，MSCs是否通过线粒体转移保护顺铂诱导的听力损失及其分子机制尚不清楚。本研究旨在阐明这一机制。
二、主要技术方法
研究人员采用人脐带来源MSCs，在C57BL/6小鼠顺铂耳毒性模型中通过尾静脉注射给药。关键技术包括：听觉脑干反应（Auditory brainstem response, ABR）测试评估听力功能；89Zr放射性标记联合PET/MR成像追踪MSCs体内归巢；免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察线粒体转移及TNT结构；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行代谢组学和靶向代谢物分析；流式细胞术分选及Seahorse代谢分析检测线粒体功能；RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析；活性基团蛋白质谱（ABPP-MS）鉴定DMF靶点；表面等离子共振（Surface plasmon resonance, SPR）、微量热泳动（Microscale thermophoresis, MST）和细胞热转变分析（Cellular thermal shift assay, CETSA）验证结合；免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）结合质谱鉴定相互作用蛋白；利用腺相关病毒（AAV-ie）介导的基因沉默和条件性基因敲除小鼠（Pax2-Ppp1cb+/?）进行功能验证。
三、研究结果
1. 归巢耳蜗的MSCs通过恢复SGN线粒体功能减轻听力损失
全身给药的MSCs在顺铂处理后优先归巢至耳蜗螺旋神经元（SGNs），主要通过CXCL10-CXCR3趋化因子轴被招募。ABR测试显示MSC治疗显著降低顺铂引起的各频率听阈升高。直接接触共培养比间接共培养更能增强SGN活力、提高ATP产生、减少活性氧（ROS）和caspase-3活性，并改善线粒体呼吸功能，表明MSCs通过直接细胞间相互作用发挥保护作用。
2. 细胞间纳米管使MSCs向受损SGNs转移线粒体
约60%的顺铂处理SGNs中含有来自MSCs的线粒体，且转移效率高于未损伤组。扫描电镜和共聚焦成像证实MSCs通过TNTs将完整线粒体转运至SGNs。过表达线粒体转运调控因子RHOT1增强了MSCs的保护效果，而TNT抑制剂nocodazole则消除线粒体转移和保护作用。单独添加外源性分离线粒体仅提供部分保护，效果不及直接MSC给药。
3. MSC来源的线粒体富马酸盐保护SGNs并恢复听力
代谢组学分析显示接受线粒体的Mito+ SGNs中三羧酸循环（TCA cycle）代谢物显著改变，其中富马酸盐（fumarate）变化最为显著。顺铂处理的SGN条件培养基上调MSCs中琥珀酸脱氢酶（SDHD）mRNA水平，而SDHD敲低不影响线粒体转移但消除了MSCs的保护作用。富马酸二甲酯（DMF）——临床可用的富马酸盐衍生物——呈浓度依赖性地保护SGNs、改善线粒体功能，且不干扰顺铂的抗肿瘤活性。
4. 富马酸盐衍生物增强线粒体自噬以保护SGNs免受顺铂损伤
RNA-seq和KEGG分析显示DMF处理显著富集自噬和线粒体自噬相关通路。mCherry-EGFP-LC3报告系统、Western blotting、免疫荧光染色、Mtphagy/Lyso染料及mito-Keima荧光报告系统均证实DMF促进顺铂损伤SGNs中的线粒体自噬。透射电镜观察到自噬体包裹受损线粒体。
5. 富马酸盐衍生物在自噬过程中直接修饰PPP1CB
ABPP-MS鉴定PPP1CB为DMF的潜在靶点，SPR、MST、CETSA及生物素-DMF下拉实验验证了二者的直接结合。竞争性碘乙酰胺-脱硫生物素（IA-DTB）标记确定C126为主要结合位点，LC-MS/MS确认C126肽段发生144.04 Da的质量偏移。分子对接进一步验证C126为关键相互作用位点。PPP1CB主要定位于耳蜗SGN区域，且NRF2敲低不影响DMF的保护作用，表明PPP1CB而非NRF2介导了DMF的作用。
6. 富马酸盐衍生物阻断PPP1CB介导的MFN2去磷酸化促进线粒体自噬
IP-MS鉴定出MFN2为PPP1CB的结合蛋白，Co-IP证实DMF在顺铂应激下显著减弱PPP1CB-MFN2相互作用，且该效应依赖于PPP1CB的C126位点。MFN2的GTPase结构域负责与PPP1CB结合。体外磷酸酶实验证明PPP1CB去磷酸化MFN2的Thr111位点，而DMF通过阻断这一相互作用维持MFN2的磷酸化状态，从而促进PINK1-Parkin介导的线粒体自噬。
7. PPP1CB敲低减轻顺铂诱导的听力损失
AAV-ie介导的Ppp1cb敲低有效保护顺铂处理小鼠的听功能，减少SGNs和毛细胞（HCs）丢失，并促进线粒体自噬。耳蜗特异性Ppp1cb杂合敲除小鼠（Pax2-Ppp1cb+/?）同样显著减轻顺铂诱导的ABR阈值升高和SGN损伤，进一步验证PPP1CB作为治疗靶点的可行性。
四、讨论与结论
本研究表明，全身给药的MSCs通过TNTs向受损SGNs转移线粒体，恢复线粒体代谢并增加富马酸盐水平。富马酸盐或其衍生物DMF通过共价修饰磷酸酶PPP1CB的C126位点，阻断PPP1CB对MFN2 Thr111的去磷酸化，从而增强PINK1-Parkin介导的线粒体自噬，促进受损线粒体清除。同时，MSCs提供的健康线粒体共同构成线粒体替换过程，治疗SNHL。
研究揭示了MSCs通过“新旧交替”（吐故纳新）的线粒体替换机制发挥作用——同时递送健康线粒体并促进受损线粒体清除。DMF作为一种FDA批准的用于多发性硬化的药物，具有良好的口服生物利用度和细胞通透性，且不干扰顺铂抗肿瘤活性，具备临床转化潜力。PPP1CB被鉴定为MSC-富马酸盐应答的下游分子靶点和SGNs中线粒体自噬的关键负调控因子，其C126位点的共价修饰为精准调控提供了新策略。然而，研究局限性在于所有体内实验均基于小鼠模型，MSC介导的线粒体转移和富马酸盐-PPP1CB-MFN2通路在人类中的保守性尚不清楚。此外，MSCs和DMF对毛细胞的保护机制仍需进一步阐明。
研究结论： 本研究揭示了一种此前未被认识的机制——MSCs通过协调递送健康线粒体和通过富马酸盐介导的PPP1CB-MFN2相互作用抑制来促进线粒体自噬，从而保护顺铂诱导的SNHL。与常规药理学方法相比，MSCs能够归巢至受损耳蜗细胞并发挥多效治疗作用，未来不仅可用于治疗顺铂耳毒性，还可应用于噪声性聋和老年性聋等线粒体功能障碍相关的听力损失，以及作为人工耳蜗植入的辅助策略。
