《Genes》：Research Progress on the Application of Nanopore Long-Read Sequencing Combined with DNA Methylation Marking in Complex Forensic Evidence
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背景：在复杂法医物证分析中，针对高度降解、微量或混合样本，传统检测方法存在分型成功率低、信息维度有限等局限。方法：本研究系统考察纳米孔长读长测序（nanopore long-read sequencing）联合DNA甲基化图谱分析（DNA methylatio
背景：在复杂法医物证分析中，针对高度降解、微量或混合样本，传统检测方法存在分型成功率低、信息维度有限等局限。方法：本研究系统考察纳米孔长读长测序（nanopore long-read sequencing）联合DNA甲基化图谱分析（DNA methylation profiling）的技术原理与兼容性，识别提高微量检材灵敏度的优化策略，提升甲基化位点解读准确性，例如NanoFreeLunch，其无需原始信号并利用碱基质量/错误模式，与基准区域甲基化水平达到0.97–0.99相关性，并简化文库构建流程，同时通过国内外案例研究评估其实际效能。结果：研究表明，该技术能够同时获取基因组序列与表观遗传信息（epigenetic information），促进多维鉴定，包括个体识别（personal identification）、年龄估计（age estimation）和体液鉴定（body fluid identification），即使在高度降解样本中，其位点检出率也显著高于传统方法。结论：未来应聚焦技术标准化（standardization）和专用数据库（specialized databases）开发，进一步完善法医调查应用框架，从而为复杂法医物证分析提供稳健的技术支持。
1. 引言
法医鉴定在案件侦破和司法判定中具有关键作用。然而，高度降解、微量及混合样本仍是实践中的基本挑战，限制传统技术在案件调查中的效能。短串联重复序列（short tandem repeat, STR）分型、实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR）质量评估、线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）测序及常规PCR扩增等方法虽已成熟，但存在依赖长片段、低模板量不稳定、信息维度有限、难以整合序列与表观遗传数据等局限，导致复杂检材的个体识别能力和延伸推断能力不足。纳米孔长读长测序（nanopore long-read sequencing）无需PCR扩增即可同时读取序列和DNA甲基化信息，为疑难法医样本分析提供了新路径，尤其在年龄估计、体液鉴定和个体识别中显示出潜力。因此，系统分析纳米孔长读长测序与法医特异性甲基化标记的整合，包括技术原理、兼容性、优化策略和标准化前景，既有助于突破高度降解样本鉴定瓶颈，也可为法医物证分析从单维分型向多维综合解读提供理论基础与实践指导。文献检索通过PubMed、Web of Science、Scopus、中国知网（CNKI）、万方数据和Google Scholar进行，关键词包括纳米孔/长读长测序、DNA甲基化、法医遗传学、复杂/降解/微量物证、体液鉴定、年龄估计和STR分型等，纳入与纳米孔测序和/或DNA甲基化标记直接相关的原始研究、综述和学位论文，排除重复、非法医及缺乏方法学细节的报告。该检索为叙述性而非系统性检索。
2. 当前挑战性方法鉴定高度降解法医样本的技术瓶颈
在法医物证鉴定实践中，高度降解、微量或混合样本是传统技术难以克服的应用障碍。基于毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）的传统STR分型依赖特定长度片段扩增，当样本因环境暴露而严重降解时，长片段等位基因扩增成功率显著下降；即使采用miniSTR缩短扩增片段，荧光通道数量限制也导致无法纳入足够有效位点，使分型结果不足以进行个体识别。CE仍是法医鉴定金标准，但对高度降解DNA表现不佳，且难以平行检测单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism, SNP）、插入缺失（indel）和表观遗传标记。短读长大规模平行测序（massively parallel sequencing, MPS）可部分改善，对片段化法医模板进行高通量多重检测，提高混合样本解卷积和降解样本分型能力，但不能直接捕获天然DNA甲基化，且难以处理高重复基因组区域。相较而言，牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technology, ONT）长读长测序保留全长DNA片段，可直接读取表观遗传修饰。焦磷酸测序性别判定可检测短至45 bp片段，但仅提供单维身份信息，并可能因Amelogenin（AMEL）序列突变或性染色体变异出现无效扩增。常规短读长下一代测序依赖PCR扩增，会完全丢失DNA甲基化等表观遗传信息。复杂样本前处理亦面临挑战，Chelex-100法和磁珠法难以完全去除抑制剂或减少DNA降解；qPCR质量评估稳定性差；mtDNA测序仅能进行母系溯源，个体识别分辨率不足；微生物组分析存在动态变异和数据标准化不足；常规PCR对低模板量扩增偏倚强且易污染。这些局限共同增加复杂样本鉴定失败率。
3. 纳米孔长读长测序联合DNA甲基化的技术原理与兼容性
3.1 纳米孔长读长测序同步获取序列与甲基化信息的技术机制
纳米孔长读长测序的基本原理是利用单分子纳米孔传感技术，检测核酸分子穿过纳米孔时电流强度、频率和周期变化，从而确定序列。该方法无需PCR扩增或亚硫酸氢盐转化，即可同时获取DNA甲基化等碱基修饰信息。甲基化修饰改变DNA碱基电荷性质，使其穿过纳米孔时产生与未修饰碱基不同的电信号特征，基于这些信号建立解码模型可精确识别甲基化位点。R10.4 flowcell试剂和优化碱基识别算法可提高甲基化检测准确性。PoreFormer模型采用层次聚类和注意力机制处理电流信号；NanoFreeLunch方法不依赖原始电信号，基于碱基质量值和测序错误模式进行建模，其基因组平均甲基化水平预测与参考方法相关性为0.97–0.99。传统亚硫酸氢盐测序易导致DNA降解和短片段，而纳米孔测序可直接对天然DNA分子进行长读长测序，已实现数千至数万碱基对甚至兆碱基（Mb）尺度读长。该技术适合低起始量和高度降解样本。RCnano方法基于适配器延伸策略，测序输出较标准文库流程提高约六倍，并可检测低至0.1%丰度的甲基化位点。其无需复杂样本预处理，有利于简化法医样本文库制备；单分子检测能力也为单细胞水平同时分析甲基化和序列信息奠定基础。
3.2 法医特异性甲基化标记的筛选与应用价值
法医特异性甲基化标记筛选需满足若干标准：在降解样本中保持稳定、具有个体特异性、与法医鉴定目标强相关，并与纳米孔长读长测序能力兼容，避免片段断裂导致位点丢失。全基因组甲基化标记识别已有成熟方法，如甲基化敏感限制酶消化结合抑制性差异杂交的差异甲基化文库构建，可为法医标记发现提供方法学指导。年龄估计方面，已发现多个与年龄强相关的CpG位点；基于七个核心CpG位点的数字微滴PCR（droplet digital PCR, ddPCR）模型在十倍交叉验证中平均绝对偏差为3.45年，且无显著性别差异。体液鉴定方面，DACT1和USP49适用于精液分析，cg26107890和cg20691722可区分唾液与阴道分泌物，所需DNA量少。除常规鉴定场景外，甲基化标记在推断与案件相关的个体健康特征方面也具潜力。疾病特异性甲基化标记研究可提供参考，例如结直肠癌血液检测中全基因组甲基化筛选发现多个高特异性生物标志物，SDC2和TFPI2联合检测提高敏感性且特异性超过90%，粪便NEUROG1甲基化可作为结直肠癌和进展性腺瘤检测的辅助指标，口腔癌系统综述也表明非侵入或微创甲基化检测可用于早期疾病发现。纳米孔自适应采样技术可在单样本中同时检测年龄相关和体液特异性甲基化标记，无需特殊预处理，结果与全基因组亚硫酸氢盐测序高度一致，并可识别新的年龄相关甲基化位点。传统焦磷酸测序虽可定量甲基化，但需针对特定位点定制检测方案且样本量要求大，不适合复杂样本多标记平行分析。MGMT启动子区甲基化研究显示，纳米孔测序与焦磷酸测序结果相当，覆盖该区域全部98个CpG位点。
4. 高度降解样本处理技术挑战的优化路径
4.1 微量样本检测灵敏度提升方案
针对皮克（pg）级微量挑战性样本，当前技术通过多步优化提高灵敏度。文库制备阶段可引入多重置换扩增等全基因组扩增（whole-genome amplification, WGA）技术，减少低模板样本扩增偏倚，满足从0.0625 ng模板起始的检测需求；同时改进Chelex-100和磁珠法等提取方法，减少DNA损失和抑制剂残留。结合基于微滴数字PCR的质量评估方案，通过75 bp、145 bp和235 bp三个片段的定量分析及降解率参数计算，可精确筛选适合测序的微量样本。测序硬件方面，可改造纳米孔马达蛋白的DNA结合活性，提高单分子捕获效率，满足单拷贝级DNA片段识别需求；并开发针对微量样本的无扩增文库制备策略，防止PCR过程中甲基化信息丢失和扩增偏倚。数据分析方面，可优化信噪比降低算法，过滤低质量测序信号，提高低覆盖数据下序列和甲基化位点检测准确性。结合熵驱动级联反应和甲基化敏感内切酶富集等分子检测策略，靶甲基化区域检测灵敏度可提高100倍以上。需要指出，全基因组扩增与天然甲基化分析不易兼容。WGA仅建议用于低模板且目标为序列恢复的场景，如STR分型或物种鉴定；当需要天然甲基化信息时，不应使用WGA。相反，无扩增纳米孔文库制备对直接甲基化判定至关重要。两类目标需分别建立工作流程，不能从同一扩增模板同时实现。
4.2 甲基化位点解读准确性的优化策略
高度降解样本存在甲基化信号偏差，混合样本存在分型干扰，可通过多维算法优化和数据库支持提高解读准确性。基于纳米孔电流信号分层聚类和注意力机制的PoreFormer模型可适应多种甲基化修饰和序列多样性，降低降解信号噪声。无需原始信号的NanoFreeLunch方法可基于碱基质量值和测序错误模式建模，实现公共测序数据的定量甲基化检测，其与基准方法区域平均甲基化水平相关性可达0.97–0.99。针对混合样本分型需求，可采用结合碱基信息和原始电流信号的混合无监督聚类方法，提高短读片段和条形码样本拆分准确性，减少不同来源样本信号交叉干扰。在此基础上，建立法医特异性甲基化参考数据库，纳入不同降解水平和不同组织来源的甲基化图谱作为校正基准，并结合R10.4 flow cell化学模式和优化碱基识别算法，进一步提高位点解读一致性和准确性。对于福尔马林固定石蜡包埋（formalin fixed paraffin-embedded, FFPE）等高度降解特殊样本，可参考基于高分辨率熔解（high-resolution melting, HRM）曲线的甲基化检测质控逻辑，对样本DNA质量进行预评估和分级，匹配相应权重信号校正参数。对于微量游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）样本，优先采用单链文库方法，提高甲基化分子捕获效率。还可基于已验证的STR分型算法纠错逻辑，建立甲基化位点系统性偏差校正模型。然而，纳米孔长读长测序虽可实时、无扩增检测并保留天然甲基化，但严重降解会限制完整长分子数量；短片段降低孔利用率和数据质量，使结果强烈依赖片段长度，并需要更高最低输入量，覆盖度也可能不均，获得足够深度可能需更多DNA，与保留天然甲基化形成权衡。对高度碎片化法医样本，应报告输入阈值和片段大小分布，承认覆盖损失，并考虑补充短读长或重叠延伸PCR方法。
4.3 测序文库构建流程简化方案
为满足复杂生物样本现场快速鉴定需求，现有简化文库制备策略已取得多维突破。基于转座酶的快速文库制备可替代传统连接法，显著减少操作步骤和人力成本，并满足便携检测系统全流程需求。对于微降解样本甲基化分析，单链cfDNA文库制备相较常规双链方法具有更高分子利用效率，更适合甲基化研究。对于需同时进行多组学分析的挑战性样本，基于数字微流控的DIRECT技术可在不分离单细胞DNA甲基化谱和转录组的情况下共享文库制备，减少样本损失并同时阐明细胞基因调控网络。MspI酶切预处理的whole-genome methylation高通量测序文库构建方法可提高甲基化位点靶向捕获效率，并降低微降解样本建库门槛。与标准纳米孔文库相比，使用RC适配器的RC nano文库流程测序产量提高约六倍，并通过二次样本拆分回收42%未分类reads，显著降低初始模板需求。对于公共卫生突发事件中未知病原体现场溯源，整合纳米孔自适应采样技术可在测序过程中靶向富集目标病原体序列，提高猴痘等新发传染病现场检测效率。配套移动分析工具Genopo可将纳米孔测序数据分析流程迁移至Android设备，实现无需实验室计算资源的甲基化谱等现场解读。
5. 技术应用前景与标准化方向
目前该技术在推广中仍面临诸多障碍。法医学领域存在计算力支持不足、数据共享差、算法透明度低、机构基础设施建设受限等共性问题。纳米孔测序本身也存在数据分析复杂、原始测序错误率较高、RNA修饰检测和微生物甲基化识别中算法模型不完善、原始pod5文件庞大、检测流程不一致等问题。数字法医学领域还面临技术快速迭代和证据有效性判定规则不完善等挑战。除纳米孔相关甲基化检测技术外，微单倍型、侧流免疫分析DNA回收、法医孢子学、拉曼光谱、DNA条形码、土壤微量物证分析、法医成像以及沉积物中有机锡化合物甲基化衍生物检测等新技术也显示应用潜力。为明确各技术成熟度，可依据纳米孔测序和甲基化标记的不同应用类型和验证阶段，评估错误率、重复性、污染风险、混合样本解卷积、室间验证、群体效应和证据阈值等关键因素。相关技术实施还面临检测标准缺乏和数据库建设滞后等问题。标准化探索可包括：统一甲基化位点判读阈值，简化测序和文库构建流程；建立跨机构共享的法医特异性甲基化标记数据库，并制定全检测流程质控规范；推动技术检验结果逐步纳入司法证据有效性判定模型。研究显示，纳米孔长读长测序正成为法医年龄估计、体液鉴定、个体识别及降解或混合微量检材分析的整合平台。有研究评估PromethION 2自适应采样在低于100 ng DNA中同时进行表观遗传年龄预测和体液鉴定，低覆盖会扭曲甲基化β值并偏倚年龄估计，但线性校正可改善准确性，血液和唾液可被正确识别。另有研究展示单一ONT自适应直接测序检测可覆盖STR、SNP、InDel、mtDNA和甲基化标记，STR正确识别率为90–92%，SNP识别率为98%，mtDNA覆盖完整，但低质量样本仍具挑战。针对降解微量检材，有研究使用纳米孔测序定量血痕中大于10,000 bp的DNA片段，发现长片段比例尤其是大于50,000 bp片段随储存时间和一次水暴露而下降，将片段长度谱与血痕年龄和环境史联系起来。还有研究开发靶向mRNA纳米孔panel，包含12个体液特异性mRNA、2个参考基因和41个编码区SNP，实现体液和供者推断；外周血、精液和月经血中特异转录本reads比例超过95%，尽管存在交叉反应仍可准确聚类，分辨力为0.5645–0.9017。此外，PacBio HiFi测序无需亚硫酸氢盐处理即可产生可比CpG甲基化数据，提供高保真共识序列和准确定量甲基化检测；但法医降解样本对PacBio流程构成实际挑战，其需要更高输入量和高分子量DNA，并依赖大型实验室仪器。纳米孔测序更耐受低质量微量DNA，支持便携、实时测序，更适合法医微量样本场景，但需仔细校准甲基化信号解读。
6. 结论
总体而言，纳米孔长读长测序联合DNA甲基化分析能够在高度降解、微量及复杂混合样本中同时获取序列和表观遗传信息，有效应对传统STR、qPCR和常规短读长测序在片段长度受限、信息维度不足和扩增偏倚显著等方面的局限。通过优化样本制备和文库构建流程、提高低模板样本捕获效率、实施高精度碱基识别和甲基化解读算法，并整合法医特异性甲基化数据库与分级质控体系，该方法有望提高挑战性检材的检出率、解读准确性和结果稳定性。该技术不仅有助于拓展年龄估计、体液鉴定和个体健康特征评估等应用，也可为特殊案件中的快速溯源和证据整合提供新思路。然而，纳米孔测序仍面临固有错误率较高、算法透明度不足、标准化方案缺乏和跨机构数据库发展滞后等实际挑战。未来需聚焦检测程序标准化、阈值统一、参考数据库构建、质控标准建立以及与法医证据法规的衔接，以确保该技术在法医科学中的可持续实施和广泛采用。
