靶向GSK3β依赖性代谢-表观遗传轴重编程致病性CD4+ TH1细胞并缓解小鼠炎症性肠病

《Science Signaling》：Metabolic reprogramming of pathogenic CD4+ T helper cells attenuates inflammatory bowel disease in mice

CD4⁺效应性T辅助1（TH1）细胞驱动炎症性肠病（IBD）。在此，研究人员研究了整合的信号、代谢和表观遗传程序如何维持其致病性持续存在。研究人员发现，用甲基丙酮酸（MePyr）强制线粒体丙酮酸代谢可抑制TH1细胞效应功能，并诱导其获得调节性样表型。MePyr抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β）活性，促进代谢从糖酵解向氧化磷酸化（OXPHOS）转变，并限制细胞内乙酰辅酶A（acetyl-CoA）积聚。这种代谢重编程降低了编码炎性细胞因子的基因上的组蛋白H3乙酰化，从而降低TH1细胞相关基因表达。通过乙酸补充或组蛋白去乙酰化酶抑制恢复炎性细胞因子产生，确立了乙酰辅酶A依赖性组蛋白乙酰化作为代谢流与效应功能之间的机制联系。相反，细胞因子白细胞介素-21（IL-21）通过促进GSK3β依赖性从OXPHOS向糖酵解转变，增强TH1细胞效应活性。对克罗恩病组织的单细胞转录组分析显示，非调节性CD4⁺ T细胞中糖酵解基因程序富集。与这些发现一致，GSK3β的药理学抑制减轻了T细胞转移小鼠结肠炎模型的疾病严重程度。总之，这些发现确定了维持TH1细胞致病性的GSK3β依赖性代谢-表观遗传轴，并强调GSK3β作为IBD的潜在治疗靶点。

研究背景与问题：炎症性肠病（IBD）包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，由CD4⁺效应T细胞驱动，其中T辅助1（TH1）细胞产生干扰素-γ（IFN-γ），TH17细胞产生白细胞介素-17（IL-17A/F），在慢性炎症中持续产生IFN-γ和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），促进免疫介导疾病。T细胞活化伴随代谢重编程，效应T细胞偏好有氧糖酵解，但协调代谢状态与CD4⁺效应T细胞维持和功能的分子开关仍不清楚。因此，研究人员通过强制线粒体丙酮酸代谢，寻找控制TH1和TH17效应细胞反应的代谢检查点。

研究策略、结论与意义：研究人员建立人效应CD4⁺ T细胞体外模型，用膜通透性甲基丙酮酸（MePyr）补充TH1细胞，发现其削弱糖酵解，抑制炎性免疫反应，并获得调节性T（Treg）细胞样表型和功能。机制上，MePyr抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β）活性，激活电压依赖性阴离子通道1（VDAC1），诱导糖酵解向氧化磷酸化（OXPHOS）转变，减少乙酰辅酶A（acetyl-CoA）和组蛋白H3乙酰化，降低炎性细胞因子表达。相反，白细胞介素-21（IL-21）通过GSK3β依赖方式促进OXPHOS向糖酵解转变，增强TH1效应活性。克罗恩病炎症肠组织单细胞转录组显示非Treg CD4⁺ T细胞糖酵解基因签名富集。GSK3β药理抑制改善致病性CD4⁺ T细胞诱导的小鼠结肠炎。该研究确定线粒体丙酮酸代谢为限制炎性信号的关键代谢检查点，并将GSK3β列为慢性肠道炎症候选治疗靶点。

关键技术方法：采用Seahorse细胞外通量分析实时检测氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）；NanoString nCounter对代谢和自身免疫基因面板进行mRNA表达谱分析；Western blotting、液相色谱-质谱检测乙酰辅酶A、共聚焦显微镜与邻位连接分析（PLA）、流式细胞术、染色质免疫沉淀-qPCR（ChIP-qPCR）分析组蛋白乙酰化；CRISPR-Cas9敲除GSK3B；重新分析公开单细胞RNA测序数据集（GEO: GSE134809，来自克罗恩病患者抗TNF治疗应答者/非应答者及同一患者炎症/非炎症回肠组织）；使用CD4⁺CD45RB^high T细胞转移至Rag1^?/?小鼠的结肠炎模型。人样本来源Mayo Clinic血库健康男性供者外周血单核细胞（PBMCs）；小鼠包括C57BL/6J Rag1^?/?、野生型（WT）和Il21r^?/?。

研究结果：
1. 人效应TH1细胞显示高有氧糖酵解但低线粒体呼吸。通过Seahorse分析，与诱导性Treg（iTreg）相比，TH1和TH17糖酵解增强，TH1线粒体呼吸降低。MePyr降低pTyr²¹⁶-GSK3β，PLA显示TH1中线粒体近端活性GSK3β多于iTreg；IL-21增加pTyr²¹⁶-GSK3β。结论：效应TH1细胞稳态偏好糖酵解，GSK3β可能作为代谢检查点。
2. MePyr补充通过抑制GSK3β诱导效应TH1细胞转录重编程。NanoString代谢和自身免疫面板显示MePyr与GSK3β抑制剂LY2090314处理有重叠差异基因，上调Treg和OXPHOS相关基因，下调TH1和糖酵解基因；48小时后IFNG和TNFA mRNA降低。结论：MePyr转录重编程向Treg样代谢状态，部分与GSK3β抑制重叠。
3. MePyr补充通过抑制糖酵解诱导效应TH1细胞代谢重编程。糖酵解压力测试显示MePyr和LY2090314降低ECAR、基础糖酵解和糖酵解能力；降低己糖激酶2（HK2）丰度；早期降低pTyr²¹⁶-GSK3β，48小时降低热休克蛋白90（HSP90）；降低mTORC1下游pSer³⁷¹-p70S6K和pThr^37/46-4EBP1。结论：MePyr增强线粒体代谢使GSK3β失活，抑制HK2依赖糖酵解和mTORC1。
4. MePyr通过减弱组蛋白乙酰化抑制效应TH1细胞炎性细胞因子产生。流式显示MePyr、LY2090314、TCS2002及2-脱氧葡萄糖（2-DG）降低IFN-γ⁺和TNF-α⁺ T-bet⁺ TH1比例。ChIP-qPCR显示MePyr和LY降低TNFA启动子H3K9ac，LY还降低IFNG启动子H3K27ac/H3K9ac。MePyr降低乙酰辅酶A；乙酸钠补充或组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂TSA部分恢复细胞因子，组蛋白乙酰转移酶（HAT）抑制剂PU139阻断；MePyr预处理TH1获得抑制CD4⁺ Tresponder增殖的能力，FOXP3⁺增加。结论：MePyr通过乙酰辅酶A依赖组蛋白乙酰化降低炎性基因表达并获Treg样抑制功能。
5. IL-21诱导的GSK3β活化和代谢重编程维持TH1细胞炎症反应。Il21r^?/? TH1和TH17糖酵解降低，iTreg无差异；IL-21降低OCR，LY恢复；PLA显示GSK3β^?/? TH1中pSer-VDAC1降低，表明VDAC1是GSK3β底物；克霉唑抑制VDAC1增加IFN-γ⁺和TNF-α⁺ TH1，LY或2-DG阻断。结论：IL-21强化GSK3β激活并抑制VDAC1，促进OXPHOS向糖酵解转变和炎症反应。
6. GSK3β抑制剂预防致病性CD4⁺ T细胞诱导的小鼠结肠炎。重新分析GSE134809显示克罗恩病GIMATS^high非应答者炎症回肠FOXP3^?IL-2RA^? CD4⁺ T细胞糖酵解基因富集，炎症组织较非炎症组织也富集。CD4⁺CD45RB^high T细胞转移Rag1^?/?小鼠中，LY2090314（10 mg/kg）与Treg共转移一样保留体重、降低疾病活动指数（DAI）和鼠结肠组织学指数（MCHI）、降低血清IFN-γ和TNF-α；减少脾CD4⁺T-bet⁺和结肠CD4⁺、T-bet⁺细胞。结论：药理学抑制GSK3β改善体内致病性CD4⁺ T细胞介导结肠炎。

讨论与结论：讨论部分指出，抑制代谢检查点（包括丙酮酸脱氢酶激酶PDHK）可减弱致病性CD4⁺ T细胞功能。本研究定义TH1持续炎症反应的代谢机制：效应TH1糖酵解增加伴线粒体呼吸受限；MePyr强制线粒体代谢使GSK3β失活，减少糖酵解流，降低炎性细胞因子基因启动子组蛋白H3乙酰化，抑制IFN-γ和TNF-α产生；GSK3β抑制重现效应；乙酸补充或HDAC抑制以HAT依赖方式恢复细胞因子；IL-21增强GSK3β活化，强化OXPHOS向糖酵解转变，增强TH1炎症反应，可被GSK3β抑制逆转；克罗恩病抗TNF治疗无效患者回肠CD4⁺FOXP3^?IL-2RA^? T细胞富集GSK3β依赖糖酵解程序；LY2090314预防CD4⁺CD45RB^high T细胞介导结肠炎。结论翻译：总之，研究人员将GSK3β定义为代谢检查点，其整合微环境线索与细胞内信号网络，协调代谢、表观遗传状态以及炎性TH1细胞表型和功能。靶向该轴可重训致病性TH1细胞反应并减轻小鼠T细胞介导的结肠炎，为难治性IBD的代谢干预提供机制依据。这些发现提示，在TH1细胞中策略性抑制GSK3β和乙酸代谢可能与现有免疫疗法协同，以克服治疗耐药。