巨噬细胞通过昼夜节律调控成纤维细胞来促进胶原沉积

《iScience》：Macrophages promote collagen deposition through circadian regulation of fibroblasts

　　

## 亮点

- 巨噬细胞诱导成纤维细胞节律，驱动胶原纤维生成
- PDGFA/PDGFRα信号轴是巨噬细胞-成纤维细胞相互作用的核心
- 任一细胞类型的昼夜节律丧失均会消除胶原纤维生成
- 这种巨噬细胞-成纤维细胞相互作用可能正常伤口愈合具有重要作用

## 摘要

成纤维细胞的胶原沉积受巨噬细胞和昼夜节律调控；理解这些过程如何相互作用有助于阐明胶原组织稳态的机制。本研究揭示，巨噬细胞-成纤维细胞相互作用可增强胶原沉积，且该过程需要有功能的昼夜节律。巨噬细胞极化状态决定了成纤维细胞反应的激活方式：幼稚型和促炎型巨噬细胞需要直接的细胞-细胞接触，而抗炎型巨噬细胞则通过分泌可溶性因子发挥作用。通过质谱蛋白质组学分析鉴定出的一个关键分泌因子是PDGFA（血小板衍生生长因子α亚基）。关键发现是：缺乏PDGFA的巨噬细胞，或使用PDGFRα抑制剂处理，均表现出减弱调节成纤维细胞昼夜节律和胶原产生的能力。任一细胞类型的昼夜节律受损均导致胶原纤维生成反应减弱。这些结果证实，肺成纤维细胞中的胶原沉积通路受昼夜节律钟控制，并证明巨噬细胞能够重新同步成纤维细胞的昼夜节律，以促进胶原沉积和细胞外基质重塑，这些过程涉及伤口愈合等生理反应。

## 引言

I型胶原（胶原）是最丰富的细胞外基质（ECM）蛋白之一，其稳态调控对组织健康至关重要。胶原失调可导致纤维化和慢性伤口等疾病。参与胶原调控的关键细胞是成纤维细胞和巨噬细胞。成纤维细胞是主要的胶原产生细胞，而巨噬细胞通过分泌细胞因子和生长因子来发挥调控作用，影响成纤维细胞中的胶原合成。引人注目的是，已有报道指出巨噬细胞还可在伤口部位直接沉积胶原，提示其在细胞外基质中具有额外的调控功能。然而，尚不清楚这种沉积是否在稳态条件下也会发生。

近期研究表明，在富含胶原的组织中，如肌腱，胶原产生存在每日的激增。参与胶原生物合成的某些基因——特别是那些调控通过分泌途径转运的基因——受昼夜节律钟控制。大约50%的哺乳动物基因呈24小时周期性表达，因此维持这些钟基因（CCGs）的适当节律对稳态和健康至关重要。将CCGs与昼夜节律钟解耦联会导致伤口愈合受损，并引发一系列与细胞外基质相关的疾病，包括肺纤维化。理解调控节律性胶原分泌的机制至关重要，以便确定在非稳态条件下（如损伤反应期间）这些过程如何被破坏，从而指导开发治疗策略以恢复健康平衡状态。

巨噬细胞通过影响成纤维细胞活性和胶原沉积在组织重塑和修复中发挥关键作用。通过直接的细胞-细胞相互作用和分泌可溶性因子，巨噬细胞调节成纤维细胞行为，包括其在细胞外基质中产生和组织胶原的能力。这种相互作用对维持组织稳态和响应损伤至关重要，其失调可能驱动纤维化反应。重要的是，巨噬细胞极化状态——如促炎M1和促修复M2表型——差异性调节成纤维细胞活性，表明巨噬细胞根据生理或病理环境精细调节胶原动态变化。由于巨噬细胞已知会定位于细胞外基质/胶原沉积和重塑的高位点，这提出了巨噬细胞也可能干扰成纤维细胞昼夜节律钟以同步并增强节律性胶原产生的可能性。

我们假设巨噬细胞通过调节成纤维细胞昼夜节律钟来影响成纤维细胞的胶原沉积。为验证这一假设，我们使用免疫荧光（IF）成像评估巨噬细胞对胶原沉积的影响，并使用Per2-Luc昼夜节律报告系统（其中荧光素酶作为昼夜节律核心钟蛋白Per2的读数）研究成纤维细胞中的昼夜节律。在此，我们首次表明，无论极化状态如何（M0——幼稚型；M1——脂多糖（LPS）和干扰素-γ（IFN-γ）刺激；M2——IL-4和IL-13刺激），巨噬细胞均可增强肺成纤维细胞的昼夜节律。此外，我们观察到共培养中胶原沉积增加。引人注目的是，M0和M1巨噬细胞需要与成纤维细胞的细胞-细胞接触才能发挥影响，而仅M2巨噬细胞分泌的因子就足以驱动胶原纤维生成和昼夜节律诱导。通过质谱（MS）蛋白质组学分析，我们鉴定出血小板衍生生长因子α亚基（PDGFA）是影响成纤维细胞功能的关键M2巨噬细胞分泌因子。值得注意的是，PDGFA本身可诱导昼夜节律，但不足以促进胶原纤维生成。重要的是，敲除巨噬细胞中的PDGFA会消除其促进成纤维细胞胶原沉积和增强昼夜节律的能力；当用特异性血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）抑制剂阿伐替尼处理成纤维细胞-巨噬细胞共培养体系时，也观察到类似效果，突出了巨噬细胞诱导的PDGFA信号在成纤维细胞昼夜节律和胶原功能中的重要性。此外，巨噬细胞诱导的效果依赖于成纤维细胞和巨噬细胞都具有功能性昼夜节律；有趣的是，无论任一细胞类型的昼夜节律相位或同步性如何，巨噬细胞都可以改变成纤维细胞的相位。总之，这些结果表明，巨噬细胞通过诱导昼夜节律促进成纤维细胞的胶原沉积，其中M2来源的PDGFA在此过程中发挥关键作用。

## 结果

### 巨噬细胞通过髓系特异性机制在成纤维细胞中诱导强健的昼夜节律

我们使用来自Per2-Luc（钟蛋白Period2与荧光素酶蛋白融合）小鼠的成纤维细胞来探索巨噬细胞与成纤维细胞昼夜节律钟之间的相互作用，其中在荧光素存在时释放的发光直接反映Per2蛋白的丰度；这提供了对成纤维细胞昼夜节律的实时追踪。在生物发光记录开始约24小时后，将人THP-1细胞系单核细胞和巨噬细胞，以及原代肺泡巨噬细胞（AMs）加入到Per2-Luc成纤维细胞中。

未经处理的Per2-Luc肺成纤维细胞（黑色轨迹，图1A）显示初始小峰，代表了培养中肺成纤维细胞内源性昼夜节律的总体总和，这些节律在低水平上同步，可能是通过在更换培养基和放置培养皿时施加的机械力实现的。这种同步性迅速减弱，反映了弱细胞间钟-钟耦合和细胞分裂导致的去同步化。

**图1 Per2-Luc肺成纤维细胞与极化THP-1巨噬细胞的生物发光读数**

(A) 加入THP-1单核细胞后诱导成纤维细胞产生强健的昼夜节律。n = 4的代表性结果。

(B) 加入单核细胞后振幅倍数变化具有显著性。数据以均值±标准误表示。n = 4个生物学重复，*p < 0.05，非配对双尾t检验。

(C) 加入M0、M1和M2极化THP-1巨噬细胞后诱导Per2-Luc成纤维细胞产生强健节律，显著增加生物发光振幅。n = 3的代表性结果。

(D) 与仅成纤维细胞（LF）相比，M0、M1和M2的振幅倍数变化均显著增加。数据以均值±标准误表示。n = 3个生物学重复，*p < 0.05，单因素方差分析。

(E) 在纤维细胞昼夜节律的不同相位加入M0 THP-1来源巨噬细胞（同步后26小时，PS26；同步后31小时，PS31），分别代表昼夜振荡的上升相和下降相。n = 3的代表性结果。

(F) 周期测量显示，在PS26和PS31加入巨噬细胞均导致显著相位改变。数据以均值±标准误表示。n = 3个生物学重复，****p < 0.001，***p < 0.005，单因素方差分析。

(G) 加入体外极化的原代小鼠AMs（M0和M2）也在成纤维细胞中诱导强健节律，其中M2效应最大。n = 3的代表性结果。

(H) M0和M2的振幅倍数变化均显著增加。数据以均值±标准误表示。n = 3个生物学重复，**p < 0.01，单因素方差分析。

(I) 加入地塞米松后，M2极化Per2-Luc巨噬细胞以最高振幅维持昼夜节律。n = 3的代表性结果。

(J) 振幅倍数变化分析显示，与M0和M1巨噬细胞相比，M2巨噬细胞显著增强了昼夜节律振幅。数据以均值±标准误表示。n = 4个生物学重复，*p < 0.05，单因素方差分析。

(K) 将M1和M2极化因子加入肺中。LPS和IFN-γ（M1极化因子）以及IL-4和IL-13（M2极化因子）均未增加昼夜节律振幅。n = 3的代表性结果。

(L) 振幅倍数变化的定量分析显示，加入M1和M2极化因子后成纤维细胞昼夜节律振幅无显著增加。数据以均值±标准误表示。n = 3个生物学重复，单因素方差分析。

在约24小时后加入THP-1单核细胞（蓝色轨迹，图1A），成纤维细胞中产生持续且强健的昼夜节律超过2天。振幅变化的定量分析（图1B）表明，巨噬细胞显著增强了昼夜节律振幅。相比之下，加入上皮Eph4细胞未显著增加振幅（图S1A和S1B），提示这是巨噬细胞特异性效应。

为确认THP-1巨噬细胞是否也能诱导成纤维细胞节律，我们首先用佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）将其分化为M0，然后极化为M1（促炎型，本研究定义为LPS和IFN-γ处理48小时）或M2（抗炎型，定义为IL-4和IL-13处理48小时）状态。这使我们能够确定对成纤维细胞昼夜节律的影响是否依赖于巨噬细胞极化状态。

极化通过经典M1（CD64）和M2（TGF-β）基因标志物的qPCR分析进行验证（图S1C和S1D）。M0、M1和M2巨噬细胞均显著增加了成纤维细胞的昼夜节律振幅（图1C和1D），不同极化状态之间无显著差异。

随后我们探讨巨噬细胞的昼夜节律状态是否影响其同步化能力。用糖皮质激素地塞米松（已知可同步昼夜节律）在加入Per2-Luc成纤维细胞前1小时或24小时对巨噬细胞进行同步化。巨噬细胞的同步化状态不改变其对成纤维细胞的节律增强效应；未同步、1小时同步和24小时同步的巨噬细胞均诱导显著振幅增加（图S1E和S1F）。此外，在成纤维细胞昼夜节律循环的不同相位加入的巨噬细胞导致显著相位偏移（图1E和1F），但周期无显著变化（图S1G）；这表明驱动成纤维细胞昼夜节律改变的是巨噬细胞的存在而非其加入时间。

为确认成纤维细胞中昼夜节律的诱导不是由于种间交叉反应，我们使用从野生型（WT）小鼠肺部分离的原代小鼠AMs（即无荧光素酶活性）。随后在体外对巨噬细胞进行极化，通过qPCR分析确认（图S1H和S1I），然后加入Per2-Luc肺成纤维细胞。在此，M2极化AMs在成纤维细胞中诱导最强健的节律，其次是M0，而M1 AMs效应最小（图1G和1H）。类似地，也评估了体内极化的原代小鼠AMs的昼夜节律诱导效应。虽然M0、M1和M2巨噬细胞均增加了成纤维细胞的昼夜节律振幅，但仅M2体内极化巨噬细胞具有显著效应（图S1J和S1K）。

为评估巨噬细胞自主节律，对Per2-Luc转基因小鼠的AMs进行极化并用地塞米松同步化。所有AMs均显示出昼夜节律的同步化反应；虽然振幅测量显示，与M0和M1相比，M2 AMs的振幅增加显著。这表明M2 AMs固有地具有最高的昼夜节律振幅，并且在极化状态中能够更好地维持节律（图1I和1J）。重要的是，将M1极化因子（IFN-γ和LPS）或M2极化因子（IL-4和IL-13）加入成纤维细胞未能增强昼夜节律振幅，表明这是髓系细胞的效应（图1K和1L）。

此外，THP-1细胞被转导PER2-Luc2质粒，以测量加入野生型成纤维细胞后M0巨噬细胞的昼夜节律（图S1L）。成纤维细胞未增加M0巨噬细胞的昼夜节律振幅（图S1M）。

随后我们探讨在什么生理条件下成纤维细胞可能丧失其同步性。此前有报道称伤口愈合速度依赖于昼夜节律；在此，我们假设创伤行为本身会破坏成纤维细胞的昼夜节律。对汇合的、经地塞米松同步化的成纤维细胞进行生物发光成像，然后进行划痕损伤。

对照组与划伤孔之间的生物发光信号测量结果显示，伤口后节律减弱，提示创伤导致成纤维细胞昼夜节律紊乱，而这种紊乱可能随后通过巨噬细胞募集得以恢复（图S1N）。综合来看，这些结果表明巨噬细胞能够诱导成纤维细胞的昼夜节律，而这种昼夜节律效应是单向的，并非相互的。巨噬细胞分泌因子对成纤维细胞昼夜节律的诱导作用是通过分泌可溶性因子实现的

为了探究巨噬细胞是否通过分泌可溶性因子来影响昼夜节律振幅，我们收集了极化巨噬细胞的上清条件培养基（CM），并将其添加到Per2-Luc成纤维细胞中。THP-1 M0和M2的CM均增加了成纤维细胞的昼夜节律振幅（图2A）。然而，只有THP-1 M2巨噬细胞的CM导致振幅的统计学显著增强（图2B）。

图2 Per2-Luc肺成纤维细胞与极化THP-1巨噬细胞条件培养基的生物发光读数

(A) 将极化THP-1巨噬细胞的CM添加到Per2-Luc肺成纤维细胞中。M2巨噬细胞CM诱导成纤维细胞产生稳健的昼夜节律。为n=4的代表性结果。(B) 振幅倍数变化分析显示，虽然M0 CM和M2 CM均增加了昼夜节律振幅，但只有M2 CM的增加与未加CM的成纤维细胞相比具有统计学显著性。数据以均值±SEM表示。n=4个生物学重复，??p<0.01，单因素方差分析。(C) M2极化的AM的CM，以及较小程度的M0 AM的CM，均增强了Per2-Luc肺成纤维细胞的昼夜节律振幅。为n=3的代表性结果。(D) M2 CM显著增加了未处理的Per2-Luc成纤维细胞的昼夜节律振幅。数据以均值±SEM表示。n=3个生物学重复，?p<0.05，单因素方差分析。

同样，将体外极化的原代AM的CM添加到Per2-Luc成纤维细胞中。AM M0、M1和M2巨噬细胞的CM均促进了昼夜节律振幅的增加（图2C）。仅在AM M2巨噬细胞CM中观察到显著的振幅增加（图2D）。这些发现表明，巨噬细胞来源的可溶性因子，特别是M2极化巨噬细胞释放的因子，在增强成纤维细胞昼夜节律振幅方面起关键作用。

巨噬细胞与成纤维细胞共培养时增加胶原蛋白沉积

为了研究巨噬细胞对成纤维细胞胶原蛋白沉积的影响，我们进行了体外共培养实验，随后进行免疫荧光（IF）分析以可视化和定量成纤维细胞来源的胶原蛋白变化。极化THP-1巨噬细胞与成纤维细胞的共培养以1:5的比例接种，因为这与人体肺中巨噬细胞与成纤维细胞的比例相似。使用共聚焦显微镜可视化胶原蛋白沉积（图3A），并定量这些培养物中的胶原原纤维面积，结果以细胞核数量进行归一化（图3B）。与单独培养的成纤维细胞相比，与M0、M1或M2极化THP-1巨噬细胞共培养的肺成纤维细胞均沉积了显著更多的胶原原纤维。成纤维细胞-巨噬细胞共培养物中的纤连蛋白染色显示，添加极化巨噬细胞后纤连蛋白沉积无变化（图S2A）。这一发现证实，观察到的胶原蛋白沉积增加并非由于细胞外基质（ECM）成分的普遍上调所致。为了进一步探究这种纤维增强效应是否需要细胞间接触或通过巨噬细胞分泌的可溶性因子，我们将极化THP-1巨噬细胞的CM添加到成纤维细胞培养物中（图3C）。值得注意的是，只有M2极化巨噬细胞的CM与无CM的肺成纤维细胞培养物相比，显著增强了成纤维细胞中的胶原蛋白沉积（图3D）。

图3 有或无THP-1细胞时肺成纤维细胞沉积的胶原原纤维定量

(A) LF与THP-1巨噬细胞共培养的IF图像。上图：胶原蛋白通道；下图：伪彩色胶原蛋白（红色）和DAPI染色的细胞核（蓝色）。比例尺，10 μm。为n=6的代表性结果。(B) 成纤维细胞培养物±THP-1巨噬细胞的胶原原纤维沉积定量。数据以均值±SEM表示。n=6个生物学重复，??p<0.01，???p<0.005，单因素方差分析。(C) THP-1巨噬细胞条件培养基（CM）中成纤维细胞的IF图像。布局与图3A类似。比例尺，10 μm。为n=5的代表性结果。(D) ±巨噬细胞CM的胶原原纤维面积定量。数据以均值±SEM表示。n=5个生物学重复。??p<0.01，单因素方差分析。(E) 原代小鼠HiBiT-Col1a2成纤维细胞用极化原代AM的CM处理4天后更换新鲜培养基。48小时后测量这些培养物的培养液中发光值。发光值与培养液中Col1a2的量成正比。仅LF与经M0、M1或M2 CM处理的LF培养物之间的HiBiT发光读数无显著差异。数据以均值±SD表示。n=4个生物学重复，单因素方差分析。(F) 同样测量LF样品培养孔中的发光值，以评估发光值从而评估标记的Col1a2向基质中的沉积。M2 CM显著增加，而M1 CM显著减少了成纤维细胞来源的标记Col1a2向ECM中的沉积。数据以均值±SD表示。n=4个生物学重复，??p<0.01，????p<0.0001，单因素方差分析。

此前有报道，巨噬细胞可在小鼠心脏伤口部位沉积胶原蛋白。这里，我们在抗坏血酸存在的条件下，以不同细胞数量培养M0、M1和M2 THP-1巨噬细胞4天。只有汇合度超过80%的培养物沉积了胶原原纤维（图S2B），表明虽然巨噬细胞能够产生胶原原纤维，但不太可能在我们共培养系统中使用的细胞数量下产生原纤维。为了直接评估成纤维细胞特异性胶原蛋白沉积，我们使用了HiBiT-Col1a2成纤维细胞。这些成纤维细胞含有基因修饰的Col1a2基因，包含一个生物发光标记的胶原蛋白alpha-2(I)链（蛋白示意图见图S2C）。为了确认HiBiT标签被整合入胶原原纤维中，我们对HiBiT-Col1a2成纤维细胞进行成像，并使用抗HiBiT和抗胶原蛋白的抗体进行染色。IF成像显示HiBiT与胶原蛋白I信号共定位，表明HiBiT-胶原蛋白作为正常胶原蛋白被整合入原纤维中（图S2D）。然后将HiBiT-Col1a2成纤维细胞与巨噬细胞CM共培养四天。通过测量两个不同取样点的相对发光值来定量胶原蛋白沉积：(1) 释放到培养基中的胶原蛋白（CM，即分泌的胶原原三聚体）和(2) 沉积到ECM中的胶原蛋白（即胶原原纤维）（图3E和3F）。成纤维细胞CM的发光读数显示，与巨噬细胞共培养时胶原蛋白释放无显著变化（图3E）。然而，沉积到ECM中的胶原蛋白的发光读数显示，M2 CM显著增加了胶原蛋白发光读数，表明胶原蛋白沉积增强（图3F）。M1 CM导致ECM胶原蛋白沉积显著减少。

为了确定胶原蛋白沉积增加是否是由于成纤维细胞中胶原蛋白基因表达升高从而导致蛋白质产量增加，我们在添加极化THP-1巨噬细胞和CM后，通过qPCR定量Col1a1基因表达。巨噬细胞细胞或CM均未影响成纤维细胞中的Col1a1表达，表明胶原蛋白沉积的增加并非通过转录调控实现（图S2E和S2F）。

成纤维细胞中胶原蛋白沉积依赖于功能正常的昼夜节律钟

我们此前已发现肌腱成纤维细胞中胶原蛋白分泌和沉积依赖于昼夜节律。在此，为了评估昼夜节律动态对肺中胶原原纤维沉积的影响，我们在24小时内以4小时间隔对肺成纤维细胞培养物进行IF分析。胶原原纤维沉积在成纤维细胞单培养和与THP-1巨噬细胞共培养物中均表现出节律性（分别为图4A和4B），其中共培养物在原纤维数量峰值时具有更大的胶原原纤维面积，由代表性图像显示PS 35小时（同步化后35小时）的胶原原纤维少于PS43（同步化后43小时）（图4C）。

图4 肺成纤维细胞中昼夜节律动态与胶原蛋白沉积的关系

(A) 成纤维细胞单培养在与地塞米松同步化后24小时内节律性地沉积胶原蛋白。使用R中cosinor2包进行昼夜节律分析以确定节律性，拟合余弦模型并评估节律性。为n=3的代表性结果。p=0.00038，p值使用R中cosinor.detect()函数计算。(B) 成纤维细胞与巨噬细胞共培养在与地塞米松同步化后24小时内节律性地沉积胶原蛋白，且在峰值时间（PS43）具有比单培养高得多的胶原蛋白面积。使用R中cosinor2包进行昼夜节律分析以确定节律性，拟合余弦模型并评估节律性。为n=3的代表性结果。p=0.00224，p值使用R中cosinor.detect()函数计算。(C) 肺成纤维细胞（LF）单培养和与M0 THP-1巨噬细胞共培养物中同步化后35和43小时的胶原原纤维IF图像。为n=3的代表性结果。(D) 生物发光读数显示地塞米松在Per2-Luc WT成纤维细胞中启动了节律，但在ClockΔ19成纤维细胞中未启动。为n=3的代表性结果。(E) ClockΔ19和WT成纤维细胞培养物中胶原蛋白的IF染色显示了胶原蛋白（红色）和细胞核（蓝色）的伪彩色图像（上）和灰度胶原蛋白图像。比例尺，10 μm。为n=7的代表性结果。(F) ClockΔ19 LF单独与WT LF的胶原蛋白沉积定量显示，ClockΔ19成纤维细胞沉积的胶原蛋白显著少于WT LF。数据以均值±SEM表示。n=7个生物学重复，?p<0.05，非配对双尾t检验。(G) 代表性IF图像显示ClockΔ19成纤维细胞单独与极化巨噬细胞共培养。比例尺，10 μm。为n=6的代表性结果。(H) 胶原蛋白面积定量显示，极化巨噬细胞未增加ClockΔ19成纤维细胞中的胶原蛋白沉积，单培养和共培养物中观察到相似的胶原蛋白水平。数据以均值±SEM表示。n=6个生物学重复，单因素方差分析。(I) 代表性IF图像显示ClockΔ19成纤维细胞单独与极化巨噬细胞CM共培养。比例尺，10 μm。为n=6的代表性结果。(J) 极化巨噬细胞的CM未增加ClockΔ19成纤维细胞中的胶原蛋白沉积，相反M0和M1 CM导致胶原蛋白信号降低。数据以均值±SEM表示。除ClockΔ19成纤维细胞单独外均为n=5个生物学重复（ClockΔ19成纤维细胞单独n=6），??p<0.01，单因素方差分析。(K) 代表性IF图像显示LF单独单培养与从野生型或Col6a1-Cre BMALko小鼠（BMALko）中分离的原代肺泡巨噬细胞（AM）或腹膜巨噬细胞（PM）共培养。上图：DAPI显示细胞核；下图：胶原蛋白I染色。比例尺，20 μm。为n=4的代表性结果。(L) 胶原原纤维强度定量显示，原代巨噬细胞（AM和PM）显著增加了LF中的胶原蛋白沉积，当原代巨噬细胞从Col6a1-Cre BMALko小鼠（BMALkoAM和BMALkoPM）中分离时，这种效应被消除。数据以均值±SEM表示。跨n=4个生物学重复超过6个技术重复，?p<0.05，???p<0.005，????p<0.001，单因素方差分析。

为了进一步探究昼夜节律钟在此过程中的作用，我们评估了携带突变Clock基因（ClockΔ19，导致CLOCK蛋白C末端51个氨基酸缺失，从而损害昼夜节律）的成纤维细胞。生物发光记录显示，除地塞米松同步化后出现的初始峰值外，几乎没有节律活动（图4D）。添加巨噬细胞未能挽救这些Per2-Luc ClockΔ19成纤维细胞中的节律（图S3A）。

ClockΔ19成纤维细胞与WT成纤维细胞的胶原蛋白沉积进行比较。IF分析显示ClockΔ19肺成纤维细胞培养物中胶原蛋白沉积显著减少（图4E和4F），表明完整的成纤维细胞昼夜节律钟在调节胶原蛋白合成和ECM动态中起关键作用。为了确定巨噬细胞是否能补偿ClockΔ19成纤维细胞中受损的胶原蛋白沉积昼夜节律调控，我们将这些细胞与极化THP-1巨噬细胞共培养或用巨噬细胞CM处理。IF图像和定量结果表明，与M0、M1或M2巨噬细胞共培养未能挽救ClockΔ19成纤维细胞中的胶原蛋白沉积（图4G和4H）。有趣的是，将M0、M1或M2巨噬细胞CM添加到ClockΔ19成纤维细胞中似乎降低了无钟成纤维细胞中的胶原蛋白信号（图4I和4J）。综合来看，这些发现突出了成纤维细胞对完整昼夜节律钟在ECM重塑中的依赖性。当用小分子Cry1/Cry2稳定剂KL001处理成纤维细胞-巨噬细胞共培养物时，进一步证实了昼夜节律的参与，其中5 μM处理降低了昼夜节律（图S3B），也显著抑制了巨噬细胞诱导的胶原蛋白沉积（图S3C和S3D）。值得注意的是，当将来自Col6a1-Cre BMALfl/fl小鼠（其中昼夜节律被消除或减弱，图S3E和S3F）的巨噬细胞与正常肺成纤维细胞共培养时，诱导胶原蛋白沉积的效应也显著降低至基线单培养水平（图4K和4L）。

这强调了功能性昼夜节律对于成纤维细胞和巨噬细胞中的胶原沉积都是必需的。然而需要注意的是，成纤维细胞对胶原沉积的并非所有影响都需要昼夜节律的增强，例如在治疗情况下。在此，TGFβ1（5 ng/mL）处理增加了胶原I型沉积，而没有影响昼夜节律（图S3G和S3H）。PDGFA在M2条件培养基中高度上调由于M2条件培养基诱导了最显著的昼夜节律并增强了成纤维细胞中的胶原沉积，我们旨在鉴定负责这一变化的因子。通过质谱分析M0、M1和M2 THP-1巨噬细胞条件培养基中显著上调的蛋白质，与M0和M1条件培养基相比，鉴定出M2条件培养基中显著上调的蛋白质。通过k-means聚类方法对质谱鉴定的蛋白质进行聚类，得到两个不同的聚类。如果蛋白质表现出倍数变化（FC）≥ 2且p值≤ 0.05，则认为其显著差异表达。聚类1包括与M0和M2条件培养基相比在M1条件培养基中上调的蛋白质（图5A）。该聚类中已确立的已知M1表达蛋白包括CXCL8和CXCL10，它们是与M2条件培养基相比差异表达最显著的基因之一，证实了巨噬细胞的分化状态。聚类2包含在M2条件培养基中上调的蛋白质，M2巨噬细胞在蛋白质组学上显示与M0比与M1更相似（图5B）。在M2条件培养基中升高的蛋白质中，PDGFA是最显著差异表达的，与M0和M1条件培养基相比表现出强烈正值的log2倍数变化值。图5 M0、M1和M2 AM条件培养基中差异表达蛋白的比较蛋白质组学分析（A）基于曼彻斯特蛋白质分析器处理质谱数据，对M0、M1和M2 AM条件培养基中差异表达蛋白质进行热图分析。倍数变化值（≥ 2，p ≤ 0.05）使用k-means进行聚类。聚类1突出显示M1条件培养基中上调的蛋白质，聚类2显示M2条件培养基中上调的蛋白质。n = 3次生物学重复。（B）聚类2包括PDGFA，该蛋白在M2条件培养基中高表达，但在M0或M1条件培养基中不表达。n = 3次生物学重复。（C）M2条件培养基与M0条件培养基中蛋白质的火山图。M0条件培养基中显著上调的蛋白质出现在左侧，而M2条件培养基中上调的蛋白质（包括最突出的PDGFA）出现在右侧。n = 3次生物学重复。（D）柱状图显示仅在M2条件培养基样本中观察到的PDGFA阳性log2中心化强度值。n = 3次生物学重复。为了可视化相对蛋白质表达水平，使用曼彻斯特蛋白质分析器生成了火山图。这些图应用了相同的FC和p值阈值，虚线标记截止值。M2和M0条件培养基之间差异表达的蛋白质在图5C中突出显示，其中绿色点表示M2条件培养基中升高的蛋白质，粉色点表示M0条件培养基中较高的蛋白质。PDGFA显著出现在右上象限，表明其在M2条件培养基中显著上调。还进行了M2与M1条件培养基的比较，以及M1与M0条件培养基的比较（图S4A和S4B）。当数据以log2中心化强度值呈现时（图5D），PDGFA在M2条件培养基中的丰度得到了进一步强调，其中阳性仅在M2条件培养基样本中观察到。这些发现突显了PDGFA作为M2巨噬细胞来源的关键因子，可能在驱动观察到的成纤维细胞昼夜节律动态和胶原沉积效应方面发挥作用。由于PDGFA具有相对较高的热稳定性，THP-1巨噬细胞的条件培养基也经过了热处理。将培养基加热至95°C持续30分钟，冷却至室温持续30分钟，然后加入Per2-Luc肺成纤维细胞。热处理后的条件培养基诱导的成纤维细胞昼夜节律与未处理的条件培养基相似。昼夜节律振幅的定量显示热处理与未处理条件培养基之间没有显著差异（图S4C和S4D），证实了诱导节律的溶质因子的热稳定性，并提供进一步证据表明PDGFA可能参与了驱动成纤维细胞培养中的昼夜节律变化。值得注意的是，使用ConTra v3预测转录因子结合位点发现，在PDGFA启动子区域500 bp内存在一个E-box元件，表明PDGFA本身可能受昼夜节律控制。巨噬细胞来源的PDGFA增强成纤维细胞的胶原沉积并增加昼夜节律振幅我们研究了PDGFA作为增强成纤维细胞胶原沉积和昼夜节律振幅的候选蛋白质。我们首先使用重组PDGFA，浓度为17.5 ng/mL，这与全血血清中测得的水平一致。将重组PDGFA加入Per2-Luc成纤维细胞显著增加了昼夜节律振幅（图6A和6B）。然后我们对THP-1细胞进行CRISPR编辑以敲除（KO）PDGFA表达（PDGFAko）。通过测序和Western blot确认了敲除效果（图S5A和S5B）。此外，与野生型THP-1巨噬细胞不同，PDGFAko THP-1不能诱导Per2-Luc成纤维细胞产生持续节律（图6C和6D）。图6 评估PDGFA增强成纤维细胞昼夜节律振幅和胶原沉积的能力（A）重组PDGFA在Per2-Luc肺成纤维细胞中诱导了强健的昼夜节律。代表n = 3。（B）振幅倍数变化分析显示PDGFA显著增强昼夜节律振幅。数据以均值±SEM表示。n = 3次生物学重复，?p < 0.05，非配对双尾t检验。（C）THP-1 PDGFAko未能诱导Per2-Luc肺成纤维细胞产生持续强健的昼夜节律。代表n = 4。（D）振幅倍数变化分析显示野生型THP-1 M0显著增加了成纤维细胞中的昼夜节律振幅，而PDGFAko THP-1 M0则没有。数据以均值±SEM表示。n = 4次生物学重复，?p < 0.05，单因素方差分析。（E）LFin与重组PDGFA共培养的免疫荧光图像。顶部图像显示DAPI染色的细胞核（蓝色）和胶原（红色）的复合图像，底部图像仅显示胶原通道。代表n = 3次生物学重复。比例尺，10 μm。（F）定量分析显示成纤维细胞培养与PDGFA孵育后胶原沉积之间没有统计学差异。数据以均值±SEM表示。n = 3次生物学重复，非配对双尾t检验。（G）成纤维细胞单培养以及与M0/M2 THP-1巨噬细胞共培养的免疫荧光图像，分别存在100 nM avapritinib（AVA）或0.1% DMSO对照溶剂。顶部图像显示DAPI染色的细胞核，底部图像显示胶原信号。代表n = 3次生物学重复。比例尺，20 μm。（H）胶原纤维面积的定量显示AVA处理消除了任何巨噬细胞诱导的胶原沉积增加。数据以均值±SEM表示。12次技术重复，涵盖n = 3次生物学重复。????p < 0.0001，单因素方差分析。（I）成纤维细胞单培养以及与PDGFA KO THP-1或野生型THP-1巨噬细胞共培养的免疫荧光图像。顶部图像显示DAPI染色的细胞核（蓝色）和胶原（绿色）的复合图像，底部图像仅显示胶原通道。代表n = 4。比例尺，100 μm。（J）定量分析显示野生型THP-1巨噬细胞显著增加了成纤维细胞中的胶原沉积，而PDGFA KO THP-1巨噬细胞则没有。数据以均值±SEM表示。n = 4次生物学重复，??p < 0.005，单因素方差分析。为了评估重组PDGFA单独是否能刺激成纤维细胞培养中的胶原沉积，我们进行了成像研究。如图6E所示，与未处理的对照组相比，用重组PDGFA处理的成纤维细胞在胶原沉积上没有观察到显著差异。胶原面积的定量分析进一步证实PDGFA单独不影响成纤维细胞中的胶原沉积（图6F）。我们考虑所使用的重组PDGFA浓度不足以诱导胶原纤维形成效应，并进行了剂量反应实验，以研究较高PDGFA浓度（8.75 ng/mL至140 ng/mL）对成纤维细胞昼夜节律和胶原沉积的影响。有趣的是，大多数PDGFA剂量显示激活成纤维细胞昼夜节律的趋势，但只有17.5 ng/mL具有显著性（图S5C和S5D），且未观察到剂量依赖性反应。相比之下，重组PDGFA在所有测试剂量下均未显著增加胶原纤维面积（图S5E）。使用PDGFRα特异性抑制剂avapritinib（AVA）进一步检测了PDGFA信号对成纤维细胞胶原沉积以及昼夜节律调节的影响。在此，我们在存在100 nM AVA或溶剂（0.1% DMSO）的条件下，进行了M0和M2 THP-1来源巨噬细胞的共培养实验，发现AVA处理导致巨噬细胞诱导的胶原沉积显著减少（图6G和6H）。有趣的是，AVA处理还消除了成纤维细胞的昼夜节律；然而，这并非由于成纤维细胞死亡，因为72小时后AVA处理并未导致细胞数量发生显著变化，除了成纤维细胞-M0共培养中AVA处理导致的增加外（图S5F和S5G）。为研究PDGFA信号如何影响昼夜节律，我们进行了针对核心时钟基因的qPCR。与未处理的成纤维细胞相比，重组PDGFA处理对核心时钟基因mRNA表达没有显著影响（图S5H）；然而有趣的是，与巨噬细胞共培养的成纤维细胞BMAL和CLOCK mRNA水平升高，而这一升高被AVA处理所消除（图S5I）。这表明，特别是巨噬细胞诱导的PDGFRα信号通路在转录水平上引起了昼夜节律变化。还进行了免疫荧光成像以比较PDGFAko和野生型THP-1巨噬细胞对胶原沉积的影响（图6I）。与之前的发现一致，与野生型THP-1共培养的成纤维细胞比成纤维细胞单培养沉积了显著增加的胶原纤维（中间图像与左侧图像相比），而与PDGFAko THP-1巨噬细胞共培养的成纤维细胞的胶原纤维水平与单培养相似（右侧图像与左侧图像相比），定量分析也证实了这一点（图6J）。这表明巨噬细胞来源的PDGFA驱动了胶原纤维形成的增加。总之，这些结果鉴定出巨噬细胞来源的PDGFA/PDGFRα信号通路是增强成纤维细胞胶原沉积和昼夜节律振幅的关键因子，突显了其在巨噬细胞-成纤维细胞相互作用中的介导作用。讨论本研究提供了证据表明，极化的巨噬细胞以及M2极化巨噬细胞分泌的可溶性因子通过时钟介导的机制促进成纤维细胞中的胶原沉积。这些结果突显了巨噬细胞与成纤维细胞之间有效相互作用的重要性，并证明了功能时钟对于维持功能性细胞外基质（ECM）的必要性。因此，这些数据对组织重塑和修复过程具有重要意义。需要注意的是，通常而言，"M2极化巨噬细胞"指的是多个具有某些共同特征的亚型，如抗炎特性，但具体作用和特征取决于细胞暴露于不同的细胞因子和生长因子等。在本研究中，M2极化巨噬细胞仅指用IL-4c（体内）或IL-4和IL-13（体外）极化的naive M0巨噬细胞。尽管M0、M1和M2 THP-1巨噬细胞在与成纤维细胞共培养中都增加了胶原沉积和昼夜节律振幅，但只有M2极化巨噬细胞的条件培养基具有相同效果。这与M2巨噬细胞表型一致，该表型涉及ECM重塑和促伤口愈合特征。因此，这些发现表明巨噬细胞通过旁分泌和邻分泌信号通路调节成纤维细胞功能。然而，M2极化巨噬细胞通过升高分泌昼夜节律调节的可溶性因子，具有更强的调节成纤维细胞胶原沉积的能力——这一机制将使M2巨噬细胞能够驱动ECM重塑。我们之前已鉴定出成纤维细胞利用内吞循环作为胶原纤维形成的机制，而先前研究已发现巨噬细胞在心脏修复过程中可以直接沉积胶原。这些观察表明，在复杂环境中胶原的来源可能并非严格来自成纤维细胞样细胞。在此我们观察到，无论极化状态如何，巨噬细胞都能产生胶原纤维，尽管其形态与成纤维细胞来源的纤维不同，且仅在高细胞密度下观察到。由于我们共培养系统中的巨噬细胞数量远低于成纤维细胞，且巨噬细胞是体外不复制的终末分化细胞，因此胶原纤维很可能是仅由成纤维细胞产生的，尽管我们不能排除巨噬细胞来源的胶原可能被成纤维细胞摄取并用于纤维形成。未来可以通过在巨噬细胞中使用内源性胶原特异性HiBiT标签并与成纤维细胞共培养来解决这个问题。然后可以利用生物发光信号来确定ECM中来源于巨噬细胞的胶原量。体外极化的M0和M2 AM均增强了成纤维细胞的昼夜节律振幅，而仅体内极化的M2巨噬细胞诱导了类似效应。

这些差异可能源于初级巨噬细胞固有的变异性，受到其来源和微环境的影响。然而，M2巨噬细胞始终表现出诱导成纤维细胞昼夜节律的显著能力，突显了其在细胞间通讯和调节成纤维细胞昼夜节律动态方面的高度能力。在本研究中，我们证明了肺成纤维细胞与肌腱成纤维细胞一样，以昼夜节律的方式沉积胶原纤维；此外，无钟基因成纤维细胞在这两种情况下均表现出胶原沉积的紊乱。然而，敲除昼夜节律对胶原沉积的影响可能取决于成纤维细胞的来源组织，因为我们之前观察到无钟基因肌腱成纤维细胞沉积更多但更细的纤维，而此处的无钟基因肺成纤维细胞则严重降低了胶原纤维形成能力。我们还证明，功能性生物钟在巨噬细胞和成纤维细胞中都是驱动胶原纤维形成效应所必需的；然而，昼夜节律状态（即同步/未同步，昼夜相位上升/下降）似乎不起作用，只要昼夜节律能够被调节即可。我们观察到，M2分泌因子特别能显著诱导成纤维细胞的昼夜节律和胶原反应。对M0、M1和M2巨噬细胞分泌组的质谱分析鉴定出超过1000种蛋白质，进一步筛选去除诱饵和已知污染物，并以成对方式（M0 vs. M2，M1 vs. M2）进行分析，鉴定出每种比较中35个差异表达最显著（即最上调和最下调）的蛋白质。PDGFA被鉴定为M2条件培养基（CM）中相对于M0 CM和M1 CM最上调的蛋白质，提示其是巨噬细胞分泌的关键因子，通过钟依赖性机制驱动胶原沉积增加。支持这一假设的证据来自以下观察：M2条件培养基的热处理并未降低其增强成纤维细胞昼夜节律振幅的能力，这与PDGFA已知的热稳定性一致。在我们的研究中，重组PDGFA显著增强了成纤维细胞的昼夜节律振幅。此外，虽然野生型THP-1巨噬细胞能增加成纤维细胞的昼夜节律振幅，但缺乏PDGFA的THP-1巨噬细胞（PDGFA^ko）未能产生相同效果。PDGFRα特异性抑制剂阿伐替尼也可抑制成纤维细胞的昼夜节律，证明PDGFA信号在共培养系统中对增强昼夜节律振幅至关重要。虽然PDGFA仅在M2极化巨噬细胞的CM中被发现高度上调，但未极化的PDGFA^ko THP-1巨噬细胞无法增强成纤维细胞的胶原沉积，而其野生型对照则可以。这表明即使低水平的PDGFA也可能是促进所有表型巨噬细胞与成纤维细胞之间有效细胞间相互作用所必需的。我们的PDGFRα抑制剂研究支持了这一假设，该抑制剂消除了M0和M2巨噬细胞引起的胶原诱导反应，证实了巨噬细胞来源的PDGFA与胶原沉积之间的关系。支持这一假设的是，我们的数据显示M0和M1巨噬细胞都需要直接细胞接触才能增加成纤维细胞的胶原纤维沉积。这与之前的一项研究一致，该研究表明PDGFA作为成纤维细胞的强趋化因子发挥作用。相比之下，单独使用M2巨噬细胞的CM即可促进胶原纤维沉积。然而值得注意的是，单独使用重组PDGFA，无论剂量如何（高达血清检测水平的8倍），都无法增加成纤维细胞的胶原沉积。这是一个出乎意料的发现，因为之前的数据显示PDGFRα敲除小鼠的胶原沉积显著减少，表明PDGFA信号在胶原调节中发挥关键作用。这种差异可能表明PDGF生物学的复杂性（例如，二聚化伴侣，PDGFA的长/短亚型），这在重组蛋白中可能未能体现。此外，巨噬细胞来源的PDGFA可能参与调节其他M2来源的分泌因子，这些因子调节成纤维细胞的胶原沉积反应。综合来看，这表明重组PDGFA能同步成纤维细胞的昼夜生物钟，但单独使用不足以增加成纤维细胞的胶原沉积，提示需要其他巨噬细胞来源因子协同作用。这些可能是其他分泌的细胞因子、趋化因子，或确实是microRNA（miRNA）和代谢物，它们可能与PDGFA协同作用以引发昼夜节律和胶原反应。PDGFA被预测在其启动子区域具有E-box结合位点，结合PDGFRα抑制导致成纤维细胞昼夜节律丧失的观察，提示PDGFA信号在调节成纤维细胞昼夜节律-胶原沉积方面比之前预期的发挥更重要的作用。然而，需要注意的是，虽然avapritinib是PDGFRα的高度特异性抑制剂，但仍可能存在脱靶效应（例如KIT），在本研究中无法排除。未来研究应在成纤维细胞中特异性敲除PDGFRα以验证此处提出的发现。此外，由于巨噬细胞自身的同步性并非诱导成纤维细胞中观察到的昼夜节律/胶原效应所必需的，这提示巨噬细胞分泌强有力的同步信号如PDGFA，可在一天中的任何时间重置成纤维细胞的昼夜生物钟。这可能也解释了为何巨噬细胞昼夜节律丧失后不再诱导胶原沉积，因为这很可能影响PDGFA的表达。作为生物体通常每日受到昼夜节律的同步化，一个问题是我们在此处的发现在体内层面的相关性，即在什么情况下成纤维细胞会丧失其同步性。我们的体外伤口愈合实验对此有所暗示，其中伤口愈合后成纤维细胞的昼夜节律被破坏。其他研究也表明，纤维化和癌症等病理状况也存在昼夜节律紊乱。人们可以推测，在疾病启动阶段可能已经存在低水平的昼夜节律紊乱，免疫系统试图"纠正"，而昼夜节律纠正的长期失败可能进而驱动疾病进展。免疫浸润如何在体内维持昼夜节律，以及这与组织稳态和疾病的关系如何，是另一个重要的未来研究方向。尽管如此，本研究的结果指向PDGFA/PDGFRα在同步成纤维细胞昼夜节律中的关键作用，这可能随后影响参与胶原分泌通路的CCGs的时间调节。虽然超出本研究范围，但未来研究应旨在鉴定M2 CM中与PDGFA协同增强成纤维细胞胶原沉积的附加成分。这些努力可能涉及蛋白质组和转录组分析，以全面表征M2巨噬细胞有无PDGFA的分泌组。另一种替代但不互斥的解释是，PDGFA介导的昼夜节律同步增强了成纤维细胞对其他巨噬细胞来源因子的响应性。昼夜生物钟调节参与胶原分泌通路的基因表达。通过放大昼夜节律振幅，PDGFA可能为成纤维细胞做好最佳的时间协调这些CCGs的准备，从而在存在附加信号时促进胶原沉积增加。值得注意的是，本研究使用雌雄小鼠混合进行原代细胞分离。雌雄小鼠分开饲养，我们在胶原或昼夜节律反应方面未观察到明显差异。然而，如前所述，本研究使用了2D体外检测，不能排除在更复杂的3D/离体/体内系统中性别的影响。总之，我们的发现表明M2巨噬细胞分泌多种因子驱动成纤维细胞昼夜节律同步及随后的胶原沉积。虽然PDGFA是关键介导因子，但其他可溶性因子的存在可能对观察到的效应至关重要。需要进一步研究来鉴定和表征这些因子，并阐明它们对昼夜节律调节和ECM重塑的单独和集体贡献。这些研究的见解可能指导开发治疗策略，旨在调节巨噬细胞-成纤维细胞相互作用以优化组织修复机制。研究局限性本研究已证明巨噬细胞调节成纤维细胞及随后的胶原沉积反应，暗示其在正常伤口愈合反应中的作用，并确定PDGFA/PDGFRα为关键信号轴。一个局限是研究仅在体外系统中进行，应在体内确认。此外，PDGFA信号是否也具有昼夜依赖性，以及这如何控制成纤维细胞昼夜节律仍不清楚。此外，我们在此证明了肺成纤维细胞中巨噬细胞与成纤维细胞之间的方向性控制；然而，这种反应可能是组织依赖性的。资源可用性主要联系人更多信息和资源和试剂的请求应提交给主要联系人Joan Chang（[e-mail]）并将由其处理。材料可用性本研究中生成的细胞系应主要联系人的请求提供。数据和代码可用性•质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作仓库提交至ProteomeXchange联盟，如关键资源表中所列。本论文报道的原始western blot图像和显微镜数据应由主要联系人应请求分享。•本论文不报告原始代码。•重新分析本论文报道数据所需的任何其他信息应向主要联系人请求。致谢蛋白质组学工作由Stacey Warwood协助，在生物质谱平台完成，成像在生物成像平台完成，PDGFA敲除细胞系由W.-S.L.在基因组编辑单元（GEU）生成；所有平台均位于曼彻斯特大学生物学、医学与卫生学院，并获得Wellcome、BBSRC和曼彻斯特大学战略基金的资助。我们感谢曼彻斯特大学生物支持平台在动物福利和饲养方面提供的专业知识和协助。本研究由MRC职业发展奖MR/W016796/1（授予J.C.）、Wellcome Trust复杂疾病中的免疫基质（ICD）博士奖学金218491/Z/19/Z（授予K.L.）、BBSRC战略Longer and Larger基金BB/T001984/1（授予M.F.A.C.、Q.-J.M.和K.E.K.）以及Wellcome 226804/Z/22/Z（授予J.C.、Q.-J.M.，GEU）资助。作者贡献J.C.、T.H.和K.E.K.构思了项目。J.C.、K.E.K.、Q.-J.M.、T.H.和A.S.M.监督了实验。K.L.、X.-Y.Z.、X.-F.Y.、M.F.A.C.、S.-Y.L.、J.C.和M.C.进行了实验并解读数据。J.J.H.进行了体内极化实验。J.K.进行了蛋白质组学实验和分析。A.S.M.、Q.-J.M.和S.-Y.L.提供了试剂和数据解读。所有作者均参与了论文撰写。利益声明作者声明不存在竞争利益。STAR★方法关键资源表试剂或资源 | 来源 | 标识符
抗体：
Anti-Collagen Alpha-1(I) Chain Carboxy-Telopeptide [LF-68] 抗体 - Kerafast - Cat#ENH018-FP, RRID:AB_3741809
Anti-Fibronectin 抗体 - Merck Sigma Aldrich - Cat#F6140, RRID:AB_476981
Anti-HiBiT 单克隆抗体 - Promega - Cat# N7200, RRID:AB_3665694
Goat anti-Mouse IgG (H + L) Cross-Adsorbed 次抗体，Alexa Fluor? 488 - A-11001 - Thermo Fisher Scientific - Cat# A-11001, RRID:AB_2534069
Goat anti-Rabbit IgG (H + L) Cross-Adsorbed 次抗体，Alexa Fluor? 488 - A-11008 - Thermo Fisher Scientific - Cat# A-11008, RRID:AB_143165
Goat anti-Mouse IgG (H + L) Cross-Adsorbed 次抗体，Alexa Fluor? 647 - A-21235 - Thermo Fisher Scientific - Cat# A-21235, RRID:AB_2535804
Goat anti-Rabbit IgG (H + L) Cross-Adsorbed 次抗体，Alexa Fluor? 647 - A-21244 - Thermo Fisher Scientific - Cat# A-21244, RRID:AB_2535812
Goat anti-Rabbit IgG (H + L) Cross-Adsorbed 次抗体，Cyanine3 - A10520 - Thermo Fisher Scientific - Cat# A10520, RRID:AB_10563288
Goat anti-Mouse IgG (H + L) Cross-Adsorbed 次抗体，Cyanine3 - A10521 - Thermo Fisher Scientific - Cat# A10521, RRID:AB_10373848
Goat anti-Rabbit IgG (H + L) Cross-Adsorbed 次抗体，Cyanine5 - A10523 - Thermo Fisher Scientific - Cat# A10523, RRID:AB_2534032
BD Pharmingen? Purified Rat Anti-Mouse IL-4 - BD Biosciences - Cat# 554387, RRID:AB_398545
Anti-Platelet-derived growth factor subunit A (PDGFA) 抗体 - RayBiotech - Cat#130-10142-20
Goat anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed 次抗体，Alexa Fluor? 680 - Thermo Fisher Scientific - Cat# A-21058, RRID:AB_2535724
细菌和病毒菌株：
per2-bre-luc2-ef1a-GFP 载体 - Qing Jun Meng 实验室 - N/A
psPAX2 包装载体 - Addgene - RRID:Addgene_12260
pMD2.G 包膜载体 - Addgene - RRID:Addgene_12259
化学品、肽和重组蛋白：
phorbol 12-myristate 13-acetate - Sigma - Cat#P8139
Mouse IL-4 Recombinant Protein, PeproTech? - Thermo Fisher Scientific - Cat#214-14
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 - Merck Sigma Aldrich - Cat#297-473-0
Collagenase, Type IV, powder - Thermo Fisher Scientific - Cat#17104019
Human TGF-beta 1 Recombinant Protein, PeproTech? - 100-21-10UG - Thermo Fisher Scientific - Cat#100-21
Avapritinib - Cambridge Bioscience - Cat#HY-101561
KL001 - SLS - Cat#SML1032
Human IFN-γ1b - Miltenyi Biotec - Cat#130-096-481
Human IL4 - Miltenyi Biotec - Cat#130-093-920
Human IL13 - Miltenyi Biotec - Cat#130-112-409
polybrene - Sigma Aldrich - Cat#TR-1003
Alt-R? S.p. Cas9 Nuclease V3 - IDT - Cat#1081058
Alt-R? CRISPR Cas9 tracrRNA - IDT - Cat#1072532
Dexamethasone - SLS - Cat#D1756
TRIzol? Reagent - Invitrogen - Cat#15596026
关键商业检测：
Nano-Glo? HiBiT Extracellular Detection Kit - Promega - Cat#N2420
TaqMan? Reverse Transcription Reagents - Invitrogen - Cat#N8080234
SensiFAST? SYBR? No-ROX kit - Bioline - Cat#BIO-98005
已存储数据：
Thp1 条件培养基质谱蛋白质组学分析 - 本论文 - ProteomeXchange PXD061123
实验模型：细胞系
人：Thp1 - 本论文 - N/A
人：HEK293T - 本论文 - N/A
鼠：永生化Per2:luc肺成纤维细胞 - 本论文 - N/A
鼠：永生化ClockΔ19 Per2:luc肺成纤维细胞 - 本论文 - N/A
实验模型：生物体/品系
鼠：PER2:Luciferase - 本论文 - RRID:IMSR_JAX:006852
鼠：Col6a1-Cre BMAL^fl/fl - 本论文 - N/A
寡核苷酸：见表S1寡核苷酸列表 - Sigma Aldrich - N/A
软件和算法：
Fiji ImageJ - https://imagej.net/software/fiji/ - https://doi.org/10.1038/nmeth.2019
BioDare2 - https://biodare2.ed.ac.uk/ - https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1912-4_2
MetaMorph - https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-analysis/metamorph-microscopy - N/A
GraphPad Prism 10.2.2 - https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ - N/A
MaxQuant 2.4.10.0 - https://maxquant.org/ - https://doi.org/10.1038/nbt.1511
Manchester Proteome Profiler - https://mpp.sbs.manchester.ac.uk/ - https://doi.org/10.64898/2026.05.14.725092
Contra v3 - http://bioit2.irc.ugent.be/contra/v3 - https://doi.org/10.1093/nar/gkx376

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实验模型和参与者详细信息

小鼠研究

所有小鼠的照料和使用均按照英国内政部法规、1986年英国《动物（科学程序）法》在内政部许可证号S1-P57F83603、P44492AC9、PP7202625下进行。

所有肺成纤维细胞（LFs）和肺泡巨噬细胞（AMs）均从不同基因型、2-3月龄、雌雄混合的C57BL/6J小鼠中分离。Per2-Luc肺成纤维细胞来源于在PER2:Luciferase报告基因背景下培育的C57BL/6J小鼠。ClockΔ19小鼠（在Per2:Luciferase报告基因背景下的C57BL/6）如前所述。

Col6a1-Cre BMALfl/fl小鼠（C57BL/6背景，携带Per2::荧光素酶报告基因）如前所述。

体内极化实验
体内AM极化实验在12周龄小鼠上进行，通过将细胞因子滴入小鼠鼻腔完成，该实验在英国内政部许可证编号P44492AC9下进行。LPS（Sigma-Aldrich，297-473-0）用于诱导M1极化（0.15 μg溶于30 μL PBS中）。白介素-4c（IL-4c）用于诱导肺泡巨噬细胞M2极化。IL-4c由重组IL-4（PeproTech，214-14）与抗IL-4抗体（BD Biosciences，554387）按IL-4与抗体1:5的比例混合制备。具体而言，将0.05 μg IL-4c稀释于30 μL磷酸盐缓冲液（PBS）中进行给药。在第0天和第2天，小鼠在异氟烷诱导麻醉下分别接受两次PBS、IL-4c或LPS的给药。第4天通过升高CO2浓度对小鼠进行安乐死处理。

原代细胞分离
原代肺成纤维细胞取自2至3月龄小鼠。组织在含胰蛋白酶（2.5 g/L）的1000 U/mL细菌胶原酶IV（Gibco，17104019）中消化，操作如前所述。

肺泡巨噬细胞（AMs）取自3月龄小鼠，通过支气管肺泡灌洗（BAL）分离，操作如前所述。

细胞培养与体外细胞分化
所有单核/巨噬细胞（原代细胞或建系细胞系）均在Roswell Park纪念研究所（RPMI 1640，Sigma-Aldrich，R8758）培养液中维持培养，该培养液含2 mM L-谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氢钠。培养基中添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、1%青霉素和链霉素抗生素（Sigma-Aldrich，P4333）、10 mM HEPES（Gibco，15630-080）及1 mM丙酮酸钠（Gibco，11360-039）。

所有成纤维细胞均在含2 mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良鹰氏培养基F-12（DMEM F-12，Gibco，11320033）中维持培养。培养基中添加10%热灭活FBS和1%抗生素。细胞在37°C、5% CO2湿润培养箱中培养。

Eph4细胞在含4500 mg/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的高糖Dulbecco改良鹰氏培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，D5796）中维持培养，培养基中添加10%热灭活FBS和1%抗生素。

除另有说明外，实验过程中所有细胞均在200 μM L-抗坏血酸存在下培养。对于共培养/处理实验，将成纤维细胞接种于8孔腔室玻片或玻璃盖玻片上，使其贴壁过夜。然后将培养基更换为含L-抗坏血酸的培养基，并视情况进行处理或不处理（即±巨噬细胞、5 ng/mL人TGFβ1（来自Peprotech 100-21）、100 nM阿伐替尼（来自Cambridge Bioscience HY-101561）、KL001（来自SLS SML1032））。随后细胞继续培养72小时，再进行如下所述的后处理。

体外THP-1单核细胞通过100 nM佛波醇-12-月桂酰-13-乙酸酯（PMA，Sigma Aldrich，P8139）孵育48小时分化为巨噬细胞。巨噬细胞通过与20 ng/mL IFN-γ（Miltenyi Biotec，130-096-481）和10 ng/mL LPS（Sigma-Aldrich，297-473-0）孵育24小时极化为M1巨噬细胞。巨噬细胞通过与20 ng/mL IL-4（Miltenyi Biotec，130-093-920）和20 ng/mL IL-13（Miltenyi Biotec，130-112-409）孵育24小时极化为M2表型。

方法细节

条件培养基（CM）的制备与收集
细胞在无血清培养基中培养至少5天。每天收取CM，并通过0.45 μM滤膜过滤以去除细胞和细胞碎片。CM随后冷冻保存直至使用。

PER2-Luc2 THP-1细胞系的构建
PER2-Luc2慢病毒由HEK293T细胞生产，并转导至THP-1细胞中。具体而言，将1 mL Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，31985062）加入含有2.5 μg psPAX2包装质粒（Addgene，12260）、2.5 μg pMD2.G包膜（Addgene，12259）和5 μg per2-bre-luc2-ef1a-GFP转移质粒（已预先构建）的Eppendorf管中。该混合物在室温下孵育15分钟。HEK293T细胞被慢病毒转染，并在收获病毒前孵育至少48小时。病毒上清液在4°C、500 × g条件下离心5分钟以沉淀残余细胞，然后通过0.45 μm聚醚砜膜滤器过滤。将THP-1细胞接种于6孔板中，加入1 mL病毒悬浮液和8 μg/μL多聚鸟氨酸（Sigma Aldrich，TR-1003）进行转导。细胞与病毒悬浮液共同孵育48小时。质粒还含有GFP标签，因此通过荧光显微镜观察荧光以确认质粒转导成功。

内源性标记的HiBiT-胶原肺成纤维细胞的构建
HiBiT-Col1a2 CRISPR编辑的肺成纤维细胞经过基因修饰，在内源位点表达携带HiBiT标签的发光标记Col1a2，标签位于N-前肽末端。该编辑策略已被证明能在有效作为胶原定量报告因子的同时保持胶原功能。

THP-1细胞系中PDGFA基因敲除（KO）的构建
采用CRISPR-Cas9技术对细胞进行处理以敲除PDGFA基因。设计了两个靶向PDGFA的sgRNA，序列分别为：cgggcacatgcttagtggca（g1）和catggaccccgtgagctctc（g2）。通过CRISPR-Cas9将sgRNA导入THP-1细胞基因组。将sgRNA与tracrRNA（IDT，1072532）按1:1比例混合后，在95°C加热5分钟。混合物冷却至室温后，在10,000 × g离心30秒。随后按1:2比例向混合物中加入Cas9（IDT，1081058）并混合。室温下放置10分钟以促进退火。然后通过Neon NxT电转系统（Thermo Fisher Scientific）将RNP复合物电穿孔递送至THP-1细胞中。

昼夜生物发光记录
来源于Per2-Luc小鼠的分离细胞及含有PER2-Luc2质粒的巨噬细胞的昼夜节律，使用LumiCycle装置（Actimetrics）进行测量，该装置可提供实时定量生物发光记录。通常至少记录4天的数据。LumiCycle分析软件（Actimetrics）采用24小时移动平均值对记录的生物发光值进行基线扣除。在适用情况下，加入100 nM地塞米松（dex，Scientific Laboratory Supplies，D1756）作为阳性对照以同步细胞的昼夜节律。在记录24小时后（除图中另有说明外）将地塞米松加入LumiCycle中的细胞培养物，以建立同步群体昼夜节律的参考模式。振幅基于处理后第二个峰值计算，使用BioDare2昼夜节律分析软件。

划痕损伤前后的生物发光成像使用Obscura Alligator发光系统（Cairn Research）进行，图像采集通过MetaMorph（Molecular Devices）完成，设置参数如下：数模转换器16位（1 MHz，EM增益），EM增益开启设为1200，垂直位移速度230.95 KHz（4.33 μsec/像素），垂直时钟电压正常，前置放大器增益2，相机快门开启曝光，曝光时间20分钟，像素合并2×2，相机状态非重叠，基线偏移0。将汇合的肺成纤维细胞单层用100 nM地塞米松同步1小时，然后更换为含1% FBS/荧光素酶的培养基，放入Alligator系统中。20小时后使用P200枪头制造划痕伤口。每25分钟采集一张图像，使用FIJI分析所得图像序列以测量生物发光信号。

HiBiT::Col1a2发光读数
表达HiBiT::Col1a2的原代小鼠肺成纤维细胞在96孔板中（每孔10,000个细胞）培养48小时后，加入含25 μg总蛋白的巨噬细胞条件培养基。成纤维细胞与CM共同孵育4天。随后移除CM，用PBS充分洗涤细胞，再加入新鲜培养基以测定胶原分泌。HiBiT::Col1a2发光读数从48小时后开始。使用Nano-Glo? HiBiT胞外检测试剂盒（Promega，N2420）和微孔板读数仪（SYNERGY neo2，BioTek）测量成纤维细胞培养孔中培养基及孔板本身中HiBiT标记的Col1a2，从而分别捕获分泌的和沉积的Col1a2。

条件培养基的质谱蛋白质组学分析
每样本制备25 μg蛋白用于质谱（MS）蛋白质组学分析，使用S-Trap柱（Protifi，C02-micro-10），并采用测序级修饰胰蛋白酶（Promega，V5111）按照已发表的方案进行消化。使用多孔寡聚R3微球（Thermo Fisher Scientific，1133907）对肽段进行脱盐。肽段在真空离心机中干燥后，重悬于10 μL含5%乙腈和0.1%甲酸的溶液中用于MS分析。MS数据使用MaxQuant 2.4.10.0版本进行无标记定量（LFQ）分析，采用数据依赖采集模式。计算相对蛋白丰度。质谱输出结果（LFQ强度值）进一步使用Perseus 2.0.11版本进行分析。数据首先经过过滤以去除污染物和诱饵序列，进行log2转换，然后将样本分为实验组。进一步过滤去除任何组别中数值不足两个的条目。log2转换产生的剩余"NaN"值采用理论正态分布进行插补，宽度为0.3，下移量为1.8。组间差异使用单因素方差分析（one-way ANOVA）评估，随后进行Tukey HSD事后检验。假发现率（FDR）小于0.05的结果被认为具有显著性。进一步的分析和图形制作使用曼彻斯特蛋白质组分析器（Manchester Proteome Profiler，曼彻斯特大学开发的基于网络的分析和平台，https://doi.org/10.64898/2026.05.14.725092）完成。使用R包处理蛋白强度数据，并进行聚类分析以实现数据可视化和显著富集蛋白的鉴定。使用DEP2 R包执行污染物过滤、归一化和缺失值插补。归一化采用方差稳定化转换（VSN），缺失值采用Missing Not At Random（MNAR）方法进行插补。选择p值0.05和2倍变化作为筛选标准，确定每次两两比较中35个调节最显著的蛋白列表。

RNA提取、cDNA合成与定量PCR
为提取RNA裂解细胞，将细胞用PBS洗涤后，加入250 μL TRIzol（Thermo Fisher Scientific，15596026）在液氮中速冻。按照制造商说明提取RNA，并使用NanoDrop One（Thermo Fisher Scientific）测定RNA浓度。使用TaqMan逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，N8080234）进行cDNA合成。每个样本使用500 ng–1000 ng RNA进行cDNA合成，同一实验中所有样本使用相同量的RNA。

qPCR预混液由2× SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific，4309155）、10 μM引物混合液（正向和反向引物）和无核酸酶水配制，随后加入cDNA。引物序列见表S1。

蛋白提取与免疫印迹
条件培养基（CM）按上述方法制备，并通过Bradford法测定蛋白浓度。免疫印迹分析每样本使用25 μg蛋白。具体而言，使用4-12% Bolt Bis-Tris胶（Thermo Fisher Scientific）通过SDS-PAGE分离样本。随后使用Biorad TransBlot? Turbo将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，用5% BSA/PBS封闭1小时，然后以1:500比例加入PDGFA一抗（RayBiotech，130-10142-20）孵育。之后以1:10,000比例加入二抗（Invitrogen，A21058）孵育。结合抗体信号通过Licor CFX系统检测。丽春红染色用于确认各样本上样量一致。

免疫荧光、染色、显微镜观察与分析
接种于盖玻片或8孔μ-玻片（Ibidi）上的细胞，采用-20°C下100%甲醇固定或4°C下4% PFA固定，然后用PBS中0.2% Triton-X进行通透。所用一抗如下：兔源pAb胶原（1:400，Kerafast ENH018-FP），鼠源mAb FN1（1:400，Sigma F6140），鼠源HiBiT pAb（Promega；N7200）。使用偶联Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Cy3和Cy5的荧光二抗（Thermo Scientific），并用DAPI（Sigma）进行细胞核复染。盖玻片使用Fluoromount G（Southern Biotech）封片。

细胞使用SP8倒置共聚焦显微镜（Leica）成像，配备HC PL Apo 40×/1.30油浸物镜。设置参数如下：针孔1 Airy unit，扫描速度400 Hz双向，格式1,024 × 1,024。采用顺序采集方式以消除通道间的串扰。胶原纤维的定量使用ImageJ/FIJI软件完成，采用已述方法进行（ISSN:1940-5901/IJCEM0059973）。具体而言，将获取的图像按通道分离，并调整阈值使仅显示胶原纤维。阈值设定后，所有图像保持一致。随后测量胶原纤维面积，并以细胞核数量进行标准化。

使用CellProfiler软件对细胞核进行计数。转录结合位点预测：使用转录因子结合位点预测工具Contra v3（http://bioit2.irc.ugent.be/contra/v3）在PDGFA的启动子区域（chr5:139470907，内含子数量：5，NM_008808）中搜索结合位点。采用默认的（实用型）位置权重矩阵（PWMs）评分匹配严格度，在500碱基的启动子区域进行搜索。搜索范围包括：E-box：Ebox、CLOCK/BMAL、Myc、Myc/Max。Cry1/Cry2效应因子包括：E-boxes/CLOCK/BMAL以及ROR/REV-ERB。D-box：E4BP、NFIL3、ATF2、CEBP。GRE：GRE、NR3C1。ROR：RORA、RORB、RORC。定量与统计分析：数据按照各图例中指定的方式呈现。样本量（N）表示每个实验中所使用的独立生物样本数量，而（n）表示技术重复次数。关于样本量、实验重复次数及统计分析的详细信息见各图例或方法部分。数据分析按照图例中的描述进行；在涉及软件阈值处理的分析中，未在盲法条件下执行。统计学显著性定义为p < 0.05。显著性水平标记如下：?p < 0.05；??p < 0.01；???p < 0.001；????p < 0.0001；以及n.s.（无显著性差异）。在适用情况下报告实际p值。所有统计分析均使用GraphPad Prism 10软件进行，或使用替代脚本（例如用于蛋白质组学分析的R脚本），具体细节如上文STAR方法中所述。补充信息（1）PDF（5.09 MB）文档S1。图S1–S5和表S1