《Applied and Environmental Microbiology》：SzMBL1, a metallo-β-lactamase gene in Sarocladium zeae, confers tolerance to the maize phytoanticipin 2-benzoxazolinone
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玉米会产生具有抗微生物和无脊椎动物抗草食特性的预先形成的次生代谢产物。产毒玉米病原真菌Fusarium verticillioides通过FDB1基因簇中的FvMBL1基因作用来解毒玉米植物预抗菌素2-苯并噁唑啉酮（BOA），该基因编码一种假定的金属-β-内酰
玉米会产生具有抗微生物和无脊椎动物抗草食特性的预先形成的次生代谢产物。产毒玉米病原真菌Fusarium verticillioides通过FDB1基因簇中的FvMBL1基因作用来解毒玉米植物预抗菌素2-苯并噁唑啉酮（BOA），该基因编码一种假定的金属-β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase）。该基因簇也存在于其他定殖玉米的真菌中，包括病原菌Colletotrichum graminicola以及本文报道的保护性内生真菌Sarocladium zeae，后者对产毒真菌表现出拮抗活性。研究人员通过基因缺失和回补互补实验评估了S. zeae中FvMBL1直系同源基因（命名为SzMBL1）的功能。缺失SzMBL1导致S. zeae无法降解BOA，因而不能在含BOA的培养基上生长，而回补的加回株则恢复了BOA耐受性，并且在某些情况下在高浓度BOA下生长增强。定量PCR（quantitative PCR, qPCR）分析显示，所有加回转化体中SzMBL1的拷贝数和表达水平均高于野生型，与其增强的生长表型一致。高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析进一步表明，SzMBL1水解BOA，最终将其生物转化为无毒代谢物N-（2-羟苯基）丙二酰胺酸（HPMA）。综上，本研究证实了参与BOA解毒的SzMBL1基因功能的保守性。该研究表明，S. zeae中含有SzMBL1的FDB1基因簇可能通过定殖玉米的真菌之间的水平基因转移获得，并在降解宿主来源的次生代谢产物中发挥作用，这些代谢产物充当筛选常与玉米关联的真菌的过滤器。
研究背景与科学问题
玉米等禾本科植物会合成苯并噁唑啉酮类（benzoxazinoids）次生代谢产物，如2,4-二羟基-1,4-苯并噁嗪-3-酮（DIBOA）及其甲氧基衍生物2,4-二羟基-7-甲氧基-1,4-苯并噁嗪-3-酮（DIMBOA）。这些化合物以无活性的糖苷形式储存在液泡中，当细胞受到生物胁迫损伤时被释放，经β-葡萄糖苷酶脱糖基化后形成不稳定的游离态，进而自发降解为更稳定的苯并噁唑啉酮类物质——2-苯并噁唑啉酮（BOA）和6-甲氧基-苯并噁唑啉-2-酮（MBOA）。BOA能够抑制病原微生物生长、阻止昆虫取食，并对多种真菌和细菌病原体具有抗性。然而，一些与玉米密切相关的真菌，如产毒病原菌Fusarium verticillioides，已经进化出对BOA的解毒机制。此前研究发现，F. verticillioides中FDB1基因簇内的FvMBL1基因编码一种假定的金属-β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase），负责BOA的水解解毒。该基因簇在另一种玉米病原菌Colletotrichum graminicola中也存在直系同源簇，暗示水平基因转移（horizontal gene transfer, HGT）可能在定殖玉米的真菌间发生，以帮助它们克服宿主植物的化学防御。然而，在有益的内生真菌Sarocladium zeae中，该基因簇及其中MBL1直系同源基因的功能尚不清楚。S. zeae是一种保护性种子传播内生真菌，能够产生吡咯西啶类抗生素，对F. verticillioides和Aspergillus flavus等产毒真菌具有拮抗活性，因此阐明其BOA耐受机制对于理解其在玉米微生态中的竞争优势和生物防治潜力具有重要意义。
研究内容与主要结论
研究人员鉴定了S. zeae NRRL6415基因组中与FvMBL1高度同源的基因，命名为SzMBL1（RZS29_002628），其编码蛋白与FvMBL1具有76%的氨基酸一致性和85%的相似性。通过基因敲除和回补互补实验，研究人员证明SzMBL1是S. zeae降解BOA并维持其在含BOA培养基上生长的必需基因。缺失SzMBL1的突变株完全丧失了对BOA的耐受性，而回补株则恢复甚至增强了BOA耐受性。进一步的定量PCR（qPCR）和反转录定量PCR（RT-qPCR）分析发现，所有回补株中SzMBL1的拷贝数和表达水平均显著高于野生型，且与增强的BOA耐受性呈正相关。高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析证实，SzMBL1催化BOA水解为中间产物2-氨基苯酚（2-AP），并进一步转化为无毒终产物N-（2-羟苯基）丙二酰胺酸（HPMA）。此外，比较基因组学分析显示，S. zeae、C. graminicola和F. verticillioides三者的FDB1直系同源基因簇具有高度共线性（synteny），支持该基因簇可能通过水平基因转移在不同玉米定殖真菌间传播的假说。该研究不仅揭示了S. zeae中SzMBL1在BOA解毒中的保守功能，还为其作为生物防治剂对抗产毒真菌提供了分子层面的新见解。
关键技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法：
- 1.
序列比对与基因簇比较分析：利用BLAST和反向BLAST在NCBI及FungiDB数据库中对S. zeae NRRL6415基因组进行搜索，鉴定FvMBL1的直系同源基因SzMBL1，并通过Clinker软件可视化比较S. zeae、C. graminicola和F. verticillioides三个物种中FDB1直系同源基因簇的共线性关系。
- 2.
体外CRISPR/Cas9基因编辑技术：采用双引导RNA（dual gRNA）系统的体外组装Cas9核糖核蛋白（ribonucleoproteins, RNPs）结合微同源臂修复模板的方法，在S. zeae原生质体中实现SzMBL1的精准敲除，并以潮霉素抗性（HygR）基因替换目标基因。
- 3.
遗传互补与表型分析：将包含SzMBL1开放阅读框（ORF）及上下游各1 kb侧翼序列的DNA片段与pGEN-NotI载体共同转化至缺失突变株的原生质体中进行回补。通过在含不同浓度BOA（0.5、0.75、1.0 mg/mL）的培养基上进行平板生长实验，结合置换多元方差分析（PERMANOVA）统计方法，定量评估野生型、缺失突变株和回补株的BOA耐受性差异。
- 4.
拷贝数与基因表达定量分析：提取各菌株基因组DNA和总RNA，分别进行qPCR和RT-qPCR，以单拷贝基因β-tubulin为内参，采用2-??Ct法计算SzMBL1的相对拷贝数和相对表达量。
- 5.
高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）代谢物分析：收集各菌株在含BOA液体培养基中培养后的上清液，通过HPLC-MS/MS检测BOA及其代谢产物2-AP和HPMA的含量，验证SzMBL1介导的BOA生物转化途径。
研究结果
FDB1基因簇与S. zeae中的SzMBL1
研究人员通过序列比对发现，S. zeae基因组中存在一个包含13个基因的FDB1直系同源基因簇，其中位于中央的第8号基因即为SzMBL1。SzMBL1编码蛋白与F. verticillioides的FvMBL1具有76%的氨基酸一致性（identity）和85%的相似性（similarity），与C. graminicola中相应的MBL1直系同源蛋白（GLRG_10902）具有74%的一致性和85%的相似性。基因簇共线性分析表明，S. zeae的FDB1簇与F. verticillioides的FDB1簇及C. graminicola的相关簇高度保守，但S. zeae和C. graminicola的簇中额外含有编码膜相关花生四烯酸/谷胱甘肽代谢蛋白（MAPEG）、羧酸酯酶家族酶、丙二酰辅酶A合成酶和醛酮还原酶的四个基因，且S. zeae簇中还独有一个编码MOSC结构域蛋白的基因。BLAST分析显示，后四个基因在F. verticillioides中并非位于FDB1簇内，而是存在于另一个已知参与BOA解毒的FDB2基因簇中。
S. zeae中SzMBL1赋予BOA耐受性
研究人员通过CRISPR/Cas9技术成功构建了两个独立的SzMBL1缺失突变株（?Szmbl1 22-2和?Szmbl1 9-1），并通过PCR验证。在含0.75 mg/mL和1.0 mg/mL BOA的培养基上，这两个缺失突变株几乎完全停止生长，而野生型菌株能够正常生长并引起培养基呈现黄-金色色素沉着，表明发生了BOA降解。通过将完整的SzMBL1基因及其侧翼序列回补至缺失突变株后，所有回补株均恢复了在含BOA培养基上的生长能力和色素沉着现象，证实SzMBL1确实是S. zeae耐受BOA所必需的基因。
增强的BOA耐受性与SzMBL1拷贝数和表达水平相关
定量生长实验结果显示，在0.5、0.75和1.0 mg/mL BOA条件下，不同菌株间的生长差异具有统计学显著性（PERMANOVA，P < 0.001），而在不含BOA的对照培养基上则无显著差异。值得注意的是，所有回补株在含BOA培养基上的生长普遍优于野生型。qPCR和RT-qPCR分析表明，所有回补株均含有多个整合的SzMBL1拷贝（相对于野生型的单拷贝），且其表达水平显著升高。其中，来自?Szmbl1 22-2背景的回补株T5的SzMBL1拷贝数高达约58个，表达水平超过野生型的1000倍，与其最强的BOA耐受性表型一致。这表明多拷贝插入和随之而来的高表达可以进一步增强真菌对BOA的耐受能力，但在最高浓度下，部分高拷贝回补株的生长变异性增大，提示可能存在解毒能力的浓度依赖性上限。
HPMA的鉴定
研究人员通过HPLC-MS/MS分析，在野生型和回补株的培养上清液中检测到一种分子离子峰为m/z 196的化合物，其二级质谱碎片中包含m/z 110的离子（对应2-AP的分子离子）以及中性丢失的丙二酰胺酸基团。通过与标准品比对，确认该化合物为N-（2-羟苯基）丙二酰胺酸（HPMA）。
SzMBL1是水解BOA所必需的
HPLC-MS/MS定量分析显示，野生型菌株在含0.5 mg/mL BOA的培养基中培养8小时后，能将BOA完全水解，产生中间产物2-AP（48.6 ng/mL）和终产物HPMA（3043.7 ng/mL）。相比之下，两个缺失突变株（?Szmbl1 22-2和?Szmbl1 9-1）的上清液中残留大量BOA（>1000 ng/mL），与未接种的空白对照培养基相当，且未检测到明显的2-AP或HPMA，表明其完全丧失了BOA水解能力。所有回补株则恢复了BOA水解活性，平均产生46.1 ng/mL的2-AP和7491.3 ng/mL的HPMA。当培养时间延长至16小时，野生型和回补株的上清液中仅残留极少量2-AP（平均11.3 ng/mL），且HPMA也被完全消耗，说明S. zeae能够彻底降解BOA及其所有代谢产物。
讨论与结论
研究人员在讨论中指出，本研究结果与先前在F. verticillioides中描述的FvMBL1功能一致，证实了这种金属-β-内酰胺酶在定殖玉米的真菌中具有保守的BOA解毒功能。FDB1直系同源基因簇的高度相似性强烈支持其通过水平基因转移在不同真菌间传播的假说。有趣的是，S. zeae和C. graminicola的FDB1簇中包含的四个额外基因，在F. verticillioides中实际上位于另一个BOA解毒相关簇FDB2中，这暗示了不同真菌在适应宿主化学防御过程中可能发生过复杂的基因簇重组或模块化交换。尽管S. zeae基因组中不存在F. verticillioides中负责将2-AP乙酰化为HPMA的关键基因NAT1的直系同源物，但HPLC-MS/MS数据清楚地表明S. zeae同样能将BOA转化为HPMA。研究人员推测，S. zeae中可能存在其他N-乙酰转移酶同源物（如NAT2和NAT3）来补偿这一功能。缺失SzMBL1导致S. zeae完全丧失BOA耐受性，凸显了该基因在克服宿主化学防线中的核心地位。增强的BOA解毒能力可能使S. zeae在玉米组织中占据更有利的生态位，从而在与无法代谢BOA的其他真菌（包括产毒病原菌）的竞争中取得优势，并提升其作为生物防治剂的潜力。
研究结论翻译：在此，研究人员在有益玉米内生真菌S. zeae中功能性地表征了一种水解性金属-β-内酰胺酶。研究人员构建了S. zeae NRRL6415的SzMBL1缺失突变株和互补菌株，以探究该基因在BOA解毒和耐受中的作用。缺失突变株在含BOA的培养基上生长严重受损，而回补的加回株则恢复了BOA耐受性，并且在大多数情况下表现出增强的生长。加回互补株中SzMBL1拷贝数和表达量的增加增强了它们在含BOA培养基上的生长，直至某些拷贝数最高的菌株超过了阈值浓度。这表明，SzMBL1在将BOA解毒为2-氨基苯酚中间体的过程中发挥着关键作用，从而克服宿主来源的化学防御，影响S. zeae在玉米中的内生定殖效率，并可能增强其作为针对F. verticillioides的生物防治剂的应用价值，减少伏马毒素污染。
