葡萄糖酸代谢调控强化纳米纤丝化细菌纤维素的生产

《Applied and Environmental Microbiology》：Enhanced production of nanofibrillated bacterial cellulose through regulation of gluconic acid metabolism

　　

高效且稳定的细菌纤维素生产对于推进可持续生物经济至关重要。本研究调查了在通气搅拌釜式反应器中，在不同培养条件下，有机酸（主要是葡萄糖酸（GA））代谢对中间驹形杆菌（Komagataeibacter intermedius）NEDO-01 菌株生产纳米纤丝化细菌纤维素（NFBC）的影响。在标准培养基中培养野生型菌株时，快速的GA产生降低了培养基pH值并耗尽了葡萄糖，抑制了细胞生长并降低了NFBC产量。然而，适当的pH控制和连续补料逆转了这些效应，使NFBC产量提高了三倍（从2.45 g/L增至7.59 g/L）。在培养葡萄糖脱氢酶基因缺陷（Δgcd）菌株时，由于缺乏pH下降和葡萄糖消耗，促进了更好的细胞生长，在无pH控制和无补料条件下，其NFBC产量比野生型培养物高1.85倍（4.53 g/L）。值得注意的是，补充GA加速了细胞生长，但显著抑制了NFBC合成，这表明GA摄取将碳通量重新导向中心代谢。在使用玉米浆（Csl）为基础的培养基中，细胞生长显著增强，NFBC产量与使用赫斯特林-施拉姆（Hestrin–Shramm）培养基时相当或更高。GA积累显著减少，从而抑制了pH波动。在这些优化条件下，研究人员测试了三种糖蜜与Csl的组合，均获得了相对较高的NFBC产量。使用这些替代培养基生产的NFBC的结构分析显示，纤维宽度分布略有差异，而结晶度和纤维宽度保持不变。总体而言，使用中间驹形杆菌属（Komagataeibacter spp.）在搅拌釜式反应器中可从多种农业副产物稳定生产质量一致的NFBC。

研究背景与目的

细菌纤维素是由特定细菌（如醋杆菌科 Acetobacteraceae）合成的化学纯度高、结晶度高的纳米纤维材料。传统上，细菌纤维素通过静态培养生产，形成凝胶状膜，这限制了规模化培养和加工成型。纳米纤丝化细菌纤维素（NFBC）是一种表面修饰的纤维素纳米纤丝，通过在气升式搅拌釜反应器（STR）中添加纤维素衍生物（如羟丙基纤维素HPC）直接培养驹形杆菌属 Komagataeibacter 获得。NFBC呈高度分散悬浮状态，便于混合、传氧和连续化工业生产，且具有长纤维、高长径比的特性。

然而，在生产过程中，驹形杆菌属会快速将葡萄糖氧化为葡萄糖酸（GA），导致pH急剧下降，这一现象称为氧化发酵。尽管氧化发酵在能量上效率低下并抑制生产者生长，但它作为营养丰富环境中的一种竞争生存策略。已有研究表明，抑制包括GA在内的副产物形成可提高驹形杆菌属的纤维素产量。但是，关于GA代谢与纤维素生物合成之间的定量关系，特别是在工业规模NFBC生产所必需的通气STR培养条件下的详细代谢行为，尚不清晰。因此，本研究旨在通过分析不同培养条件下NFBC产量与有机酸代谢的关系，特别是GA的作用，来阐明这一机制，并探索利用低成本农业副产物进行NFBC生产的可能性。

主要技术方法

1. 1.
   基因敲除突变体构建：采用无标记基因缺失方法，通过两步同源重组构建了中间驹形杆菌 NEDO-01 的葡萄糖脱氢酶基因缺陷（Δgcd）突变体。筛选过程中使用了基于靛玉红合成的蓝白斑筛选系统和* codA/codB* 反向筛选系统。
2. 2.
   搅拌釜反应器（STR）培养：在10 L搅拌釜反应器中进行所有培养实验，温度30℃，通气量1.0 vvm，溶氧控制在30%，初始pH 5.2。研究了不同条件：无pH控制无补料、仅pH控制、pH控制结合补料、以及使用不同碳氮源组合（标准HS培养基、玉米浆Csl基培养基、以及三种糖蜜）。
3. 3.
   NFBC结构与性能表征：使用原子力显微镜（AFM）观察纤维形态（宽度和高度）；使用宽角X射线衍射（WAXD）分析晶体结构、晶面间距和微晶尺寸；使用固态交叉极化魔角旋转¹³C核磁共振（NMR）波谱测定结晶度和纤维素I_α分数。

研究结果

GA积累对野生型菌株NFBC生产的影响

研究发现，野生型菌株在标准HS培养基中培养时，GA在24小时内迅速积累至最高水平（约10 g/L），导致pH下降、葡萄糖耗尽，抑制了细胞生长并降低了NFBC产量（2.45 g/L）。通过pH控制（条件2），NFBC产量提升至3.53 g/L，比生产速率提高1.6倍。结合pH控制与连续补料（条件3），NFBC产量进一步提高至7.59 g/L，实现了三倍增长。然而，过度增加补料量或初始糖浓度会导致GA过量积累，反而降低产量。这表明，对于野生型菌株，精确调控葡萄糖的添加量和时机以防止GA过度积累是高效生产NFBC的关键。

Δgcd突变体的NFBC生产**

通过构建Δgcd突变体，研究人员发现其在无pH控制条件下不积累GA，pH不下降。其NFBC总产量（4.53 g/L）比野生型在相同条件（条件1）下高出85%，比野生型在pH控制条件（条件2）下高出28%。然而，Δgcd突变体的比NFBC生产率低于野生型，且细胞生长启动延迟。当向Δgcd突变体培养基中添加GA时，细胞生长提前启动，但NFBC产量显著降低，表明GA虽能刺激中心代谢活性，但会将碳通量从纤维素合成途径转移开，甚至可能直接抑制纤维素合成。

Csl对菌株培养和NFBC生产的影响

使用玉米浆（Csl）替代蛋白胨作为氮源后，发现乳酸被快速消耗，GA积累显著减少，pH自发上升，细胞生长得到促进。在无pH控制和无补料条件下，NFBC产量（4.99 g/L）是标准HS培养基的两倍。在补料分批条件下，虽然最大比NFBC生产率低于HS培养基，但由于细胞密度更高，最终NFBC产量（6.98 g/L）与HS培养基相当。结果表明，Csl通过提供易利用的碳源（乳酸）改变了中心碳代谢，减少了葡萄糖氧化需求，从而抑制了GA积累，促进了细胞生长。

利用糖蜜和Csl生产NFBC

研究人员进一步利用三种不同类型的糖蜜（甜菜糖蜜A和B，甘蔗糖蜜SC）与Csl组合进行补料分批培养。结果显示，使用纯度较高的糖蜜A时，NFBC产量（6.78 g/L）与使用纯糖的Csl(GF)培养基相当。使用较粗制的糖蜜B和SC时，虽然NFBC生产启动有所延迟，但最终产量也较高（分别为4.95和6.84 g/L），并且相对于总糖消耗的NFBC产率更高（分别为27.5%和29.1%），表明糖蜜中的氨基酸和有机酸被优先利用，节省了果糖。

不同培养基对NFBC特性的影响

对所有条件下生产的NFBC样品进行结构分析，固态NMR和WAXD结果显示，无论使用何种培养基，NFBC的纤维素I_α分数（约70%）和结晶度（67.7%-70.3%）均保持一致，晶面间距和微晶尺寸也无明显变化。AFM图像显示所有样品均保持扁平带状纳米纤维形态，平均高度为4-6 nm，宽度在32.5-54.2 nm之间。结果表明，尽管培养基成分不同，但所生产的NFBC在分子结构和晶体结构上具有稳健性，质量一致。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究的创新之处在于首次在STR培养体系中定量表征了GA代谢与NFBC生产动力学的关系。野生型菌株中，GA的快速积累通过降低pH和消耗葡萄糖来抑制细胞增殖，从而降低NFBC产量。通过外部pH控制和适当补料可以缓解此问题。Δgcd突变体实验证实，绕过氧化发酵虽能提高总产量，但降低了比生产率，因为碳流更多地转向了生物量形成而非纤维素合成。GA的补充实验表明，GA能促进细胞生长启动，但会强烈抑制纤维素合成，暗示其可能发挥调节作用。Csl中的乳酸能被快速利用，改变中心代谢，减少GA积累并促进细胞生长。使用不同糖蜜的实验证明，可以利用低成本农业副产物实现NFBC的高效生产，且产品结构性质稳定。

研究结论：本研究定量阐明了氧化发酵产生的GA对中间驹形杆菌 NEDO-01 在STR中纤维素生产的影响。GA的快速积累独立于细菌生长并与初始葡萄糖浓度成正比，导致pH骤降和葡萄糖消耗，主要抑制细胞生长并降低纤维素产量。STR中的pH控制和受控补料有效缓解了这些影响，使NFBC产量提高了三倍。有趣的是，GA促进了细胞生长的启动，并将葡萄糖通量重定向至中心碳代谢，同时可能抑制了纤维素合成途径。研究评估了使用农业副产物进行NFBC生产的潜力，发现玉米浆中的乳酸被NEDO-01积极消耗并增强了细胞生长。尽管使用营养丰富的副产物抑制了GA产生并提高了细胞生长速率，但降低了比NFBC生产率。在Δgcd菌株培养中补充GA时，葡萄糖摄取与果糖摄取一样缓慢，但出现了碳溢流，表明仅绕过氧化发酵不足以提高纤维素产量，增强葡萄糖摄取并将其通量引导至纤维素生物合成途径是实现高NFBC生产率的关键。在优化培养条件下，使用三种糖蜜与Csl组合成功提高了NFBC产量，同时保持了高结晶度和带状纳米纤丝形态。总体而言，研究结果表明，使用中间驹形杆菌 NEDO-01 在STR中可以从各种农业副产物可靠地生产质量一致的NFBC。