《Journal of Virology》：What a tangled web we weave: how agriculture, a polyphagous insect vector, and rampant recombination drove the emergence, evolution, and economic importance of the geminivirus beet curly top virus in western North America
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甜菜曲顶病（curly top disease, CTD）以叶片卷曲和植株矮化为特征。历史性CTD约于1900年在北美西部、约于1925年在南美洲以及约于1955年中东地区独立涌现，均发生在这种旧世界（Old World, OW）作物被集约栽培之后。在这些地区
甜菜曲顶病（curly top disease, CTD）以叶片卷曲和植株矮化为特征。历史性CTD约于1900年在北美西部、约于1925年在南美洲以及约于1955年中东地区独立涌现，均发生在这种旧世界（Old World, OW）作物被集约栽培之后。在这些地区，CTD由遗传上截然不同的单组分双生病毒（monopartite geminivirus）引起，并由不同的叶蝉种类传播。在北美，CTD由11个甜菜曲顶病毒（beet curly top virus, BCTV）株系引起，并由甜菜叶蝉（beet leafhopper, BLH, Circulifer tenellus）传播。本研究利用近一个世纪以来从多种作物和地点采集的133条分离物基因组序列（包括32条来自加利福尼亚州新世界（New World, NW）作物的新近序列），研究了BCTV的涌现与演化以及农业所扮演的角色。未鉴定出新株系，且所有分离物均为重组体，具有四个保守的重组断点（recombination breakpoint）。基于重组感知的演化分析估计，BCTV约在750年前涌现，可能源自一个侵染未栽培NW植物的祖先病毒。多样化与NW作物的驯化（尤其是辣椒）、甜菜的引入以及温和型和严重型甜菜株系的涌现相关。山麓地带草类的过度放牧促进了BCTV和BLH杂草储源库的增殖。近期从NW作物和杂草中采集的分离物大多为温和型株系，揭示了一种株系更替现象。温和型株系的C4效应蛋白几乎完全无序（99%），而严重型株系仅为44%，提示其在适应性演化中发挥作用。因此，BCTV的演化与CTD生物学由农业实践、BCTV的遗传灵活性以及多食性BLH媒介共同驱动。
一、研究背景与科学问题
植物病害流行长期困扰作物生产，甚至曾改变人类历史进程，例如19世纪中叶爱尔兰的马铃薯饥荒。这些流行病的发生往往与农业实践密切相关，如在新地理区域对易感外来作物进行大规模单一栽培。19世纪末至20世纪初，由叶蝉传播的历史性病毒病害在北美西部甜菜上引发了曲顶病（CTD），在非洲玉米上引发了玉米条纹病（MSD），造成了严重的经济损失。1978年，双生病毒科（Geminiviridae）正式建立，用以归类这些新型单链DNA植物病毒。双生病毒在全球范围内感染广泛的单子叶和双子叶栽培及非栽培植物，并经由蚜虫、叶蝉、角蝉和粉虱等韧皮部取食昆虫传播，目前已涵盖15个属。
甜菜CTD在三个大陆、三个不同时间点，在甜菜集约栽培后相继涌现：北美西部（约1900年）、南美洲（约1925年）和中东（约1955年）。三个地区的症状相似，但病原病毒的生物学特性（如寄主范围和叶蝉媒介）不同。在北美西部，CTD曾是甜菜的流行性病害，但在加利福尼亚州等缺乏甜菜的地区，则成为NW作物的偶发性溢出病害。山麓地带草类的过度放牧以及入侵性NW和OW双子叶杂草的定殖，为BCTV和BLH在生长季间隙提供了储源库。在三个地区，甜菜CTD分别由三个属的高度分化的、本地演化的单组分双生病毒引起——Curtovirus属的BCTV、Topelivirus属的巴西曲顶病毒（BraCTV）以及Becurtovirus属的甜菜曲顶伊朗病毒（BCTIV），并由不同的叶蝉种类传播，这再次印证了本地演化产生遗传上不同的双生病毒、在广泛种植的易感作物上引起相似病害的现象。
BCTV是第一个被确认的单组分双生病毒，也是Curtovirus属的代表种。基于全基因组成对序列比较，已建立了11个BCTV株系：Cal-Logan（CA/Logan）、严重型（Svr）、科罗拉多（CO）、沃兰（Wor）、温和型（Mld）、辣椒黄矮（PeYD）、严重辣椒（SvrPep）、辣椒曲顶（PeCT）、叶蝉-71（LH71）、菠菜曲顶（SpCT）和金伯利-1（Kim1）。根据在甜菜上的CTD严重程度，这些株系又被分为温和型（CO、Wor、Mld）和严重型（CA/Logan、Svr、PeCT、LH71、SpCT）。已有研究显示所有BCTV株系均具有重组基因组，但关于BCTV及其媒介BLH的起源（本土或外来）以及无甜菜条件下CTD的生物学特性等问题仍悬而未决。
2013年加利福尼亚州中央谷地加工番茄上突发的CTD流行造成了约1亿美元的经济损失，引发了关于是否出现新的高毒力BCTV株系以及未来是否会发生类似流行的担忧。为解答这些问题并深入理解BCTV的起源与演化以及农业所起的作用，研究人员开展了这项综合性研究。
二、研究内容与主要结论
该研究基于133条BCTV基因组序列（涵盖近一个世纪、来自不同寄主和地点的分离物，其中包括2013至2022年间从加利福尼亚州和犹他州NW作物上采集的32条新序列）展开。研究未鉴定出新株系；所有分离物均为重组体，并鉴定出四个保守的重组断点。基于重组感知的系统发育时间尺度分析和寄主重建分析预测，BCTV约在750年前涌现，辣椒是最接近的祖先作物寄主，提示其NW起源，可能源自侵染非栽培植物的古老祖先病毒并由本土叶蝉传播。BCTV的多样化最初发生在NW作物驯化期间，并在19世纪末旧世界作物甜菜引入和集约化种植后显著加速。对近期引起加利福尼亚州NW作物和大麻CTD的BCTV分离物进行株系分型，结果显示以温和型株系为主，而非历史上的严重型甜菜株系。在山麓地带检测到的无症双子叶杂草储源库也主要感染温和型分离物。温和型株系的C4效应蛋白几乎完全无序（99%），而严重型株系仅为44%，提示其在寄主适应中发挥作用。研究揭示了BCTV在NW的涌现和漫长演化历史、农业在BCTV多样化和CTD生物学中的关键作用，以及病毒和媒介适应寄主作物变化的能力。
三、关键技术与方法
研究人员综合运用了多项关键技术：通过多重PCR和株系特异性PCR对CTD样品和杂草样品进行病毒检测与株系分型；对阳性样品进行全基因组扩增和高通量测序获得基因组序列；使用GARD、3Seq、RDP等多种方法进行重组检测与断点定位；采用基于重组的系统发育时间尺度分析（RCPT）结合贝叶斯框架估算演化速率和病毒涌现时间；运用贝叶斯天际线图（Skygrid）分析有效种群大小变化；通过祖先状态重建（ASR）、系统发育信号检验（AI、PS、MC统计量、Pagel's λ、Blomberg's K、Moran's I）和传播网络分析（StrainHub）研究寄主关联与传播动态；使用错配分布、Raggedness统计量和R2检验评估种群扩张；利用Codeml NSsite模型、BUSTED[S]、OLGenie和RELAX等分析选择压力；使用IUPred2A预测C4蛋白的内在无序倾向（IDT）。样本来自2013至2023年间加利福尼亚州中央谷地和萨克拉门托谷地的加工番茄田调查，以及2015至2018年间弗雷斯诺和克恩县西部山麓地带的杂草调查。
四、研究结果
温和型BCTV株系主导了加利福尼亚州甜菜种植后加工番茄及其他作物的CTD
2013年的CTD流行并非由新的高毒力株系引起。2014年的调查显示CTD发病率极低，表明2013年爆发无延续效应。2016至2020年间发病率持续低于5%。2021和2022年萨克拉门托谷地发生了由罕见的严重型SpCT株系引起的异常爆发。2013至2023年间采集的1,945份加工番茄CTD症状样品中，1,733份（89.1%）BCTV检测阳性，其中64.2%为温和型、29.5%为严重型、6.3%为混合感染，表明温和型株系占主导。若不计入严重型株系异常高发的2013年和2021至2022年，温和型株系占比高达79%。所有瓜类和大麻CTD样品仅感染温和型CO和Wor株系。株系特异性PCR显示CO占51%、SpCT占18%、LH71占16%、Wor占7%。2013年爆发中LH71占61.8%，但2014至2020年间降至17.7%，而CO则升至74.6%。结果表明温和型株系主导了甜菜之后NW作物和大麻的CTD，历史性甜菜株系已消失，新涌现的严重型株系可在特定年份和地点引起加工番茄CTD。
温和型BCTV株系在山麓地带双子叶杂草储源库中也占主导
2015至2018年间对弗雷斯诺和克恩县西部山麓地带的杂草调查中，未观察到CTD症状，随机采集的1,646份来自六个科的无症杂草样品中，29%存在无症BCTV感染。Chenopodium属（57%）、Sisymbrium属（57%）和Cirsium属（62%）感染率最高，Erodium、Lepidium和Capsella属较低（27%–34%）。俄罗斯蓟（Salsola属）感染率相对较低（17%）但分布广泛，是BLH繁殖寄主。滨藜（Atriplex属）感染率极高（94%）但样本量小。BCTV在BLH的冬季和早春杂草寄主以及主要夏季寄主中均有检出。与加工番茄样品类似，杂草样品中温和型株系感染率（72.2%）高于严重型（57.3%），且混合感染率（29.5%）远高于加工番茄（6.3%），表明杂草在CTD生物学中发挥关键作用，并可能通过混合感染和重组促进BCTV遗传多样性。
来自北美西部的BCTV基因组序列综合数据集
研究汇编了133条完整BCTV基因组序列，覆盖约92年（1930至2022年）。其中32条为本研究新测序的近期分离物（2009至2022年采集），来自加工番茄（19条：9 CO、7 LH71、2 Wor、1 PeCT）、瓜类（7条：4 Wor、3 CO）、甜菜（2条CO）、BLH（2条LH71）和辣椒（1条LH71）。其余101条来自GenBank。各株系序列数为：CO（39条，29%）、Wor（30条，22%）、Svr（24条，18%）、SpCT（12条，9%）、LH71（10条，8%）、CA/Logan（5条，4%）以及较少见株系（Mld、PeYD、PeCT、Kim1、SvrPep）共13条（10%）。95%的分离物来自美国西部，5%来自墨西哥。寄主方面，53%来自甜菜、22%来自番茄、9%来自辣椒、瓜类和大麻各5%、4%来自BLH成虫。
重组是BCTV所有株系涌现的驱动力
GARD分析在所有133条BCTV序列中检测到强重组信号，最佳模型支持四个重组断点（RB），分别位于V3基因5′端（位置269）、V1基因高度保守的3′端（位置1225）、C2/C3基因重叠区（位置1503）和C1基因3′端（位置2329），将基因组划分为四个具有不同演化历史的区域（模块）。3Seq和RDP方法也鉴定出相似断点。基于四个非重组区（NRR）构建的ML树的缠结图显示强烈的系统发育不一致性，证实重组导致的系统发育信号冲突。株系间重组在所有11个株系中均有检测，而株系内重组仅在较早涌现的CO、Wor和Svr株系中检测到，LH71和SpCT未检测到，可能反映其较短的演化历史。CO、Wor和Svr株系内的突变频率超过重组频率，表明突变和重组共同驱动了这些株系的遗传变异。
BCTV涌现的演化时间估计
基于重组校正的系统发育树（RCPT）和贝叶斯框架的tip-dating分析显示，数据具有充分的时序信号。BCTV最近共同祖先（TMRCA）估计约在公元1299年（95%置信区间：968–1545）涌现，演化速率为1.8 × 10?4 substitutions/site/year（CI: 1.2–2.6 × 10?4）。Skygrid图显示约750年前的初始种群扩张、约350年前的下降以及过去约300年的波动，表明多次瓶颈和遗传漂变强烈影响了BCTV种群动态。演化时间与农业历史关键转变吻合：初始涌现和多样化与作物驯化相关，第二次分化事件与19世纪末甜菜引入和集约化种植明确对应。历史性甜菜严重型株系CA/Logan和Svr约于1866年（CI: 1774–1922）涌现，温和型CO和Wor约于1897年（CI: 1835–1935）涌现。LH71的TMRCA约在1957年（CI: 1933–1972），SpCT约在1992年（CI: 1975–2003）。时间树呈现三个主要进化枝：进化枝I包含SpCT株系，位于根部；进化枝II包含历史性甜菜株系和PeCT；进化枝III为大多系群，包含SvrPep、PeYD、Mld、CO、Wor、LH71和Kim1。值得注意的是，各进化枝基部均为侵染辣椒的株系（SpCT、PeCT、SvrPep），提示BCTV的祖先病毒可能在北美西南部辣椒驯化期间引入并适应了这一寄主。
BCTV分离物的寄主关联与祖先寄主重建
系统发育信号检验（AI、PS、MC统计量）均显示BCTV系统发育与寄主植物种类存在显著关联，即感染相同寄主的分离物/株系倾向于在树上聚集。Pagel's λ（0.90；P = 4.1 × 10?9）和Blomberg's K（0.115；P = 9.9 × 10?5）均显示显著的系统发育信号，Moran's I检验也证实密切相关株系来自相同寄主。祖先状态重建（ASR）显示，没有任何作物寄主被鉴定为树根部的祖先寄主，但辣椒被推断为除SpCT外所有BCTV株系最可能的祖先寄主（PP = 0.61）。ASR确认了甜菜在BCTV演化中的关键作用，至少有四次独立的跨物种传播事件，导致了历史性CA/Logan和Svr株系（PP = 0.99）以及当代CO、Wor、LH71和Kim1株系（PP = 0.93）的涌现。使用平衡抽样数据集（n = 56）的验证分析得到了相似结果。传播网络分析显示，所有寄主（除大麻外）均为桥梁寄主，甜菜是病原传播最重要的枢纽（betweenness = 3.83），BCTV从甜菜向番茄、大麻和瓜类的传播占主导，而反向传播未发生。
BCTV株系的种群遗传学
温和型株系（CO和Wor）的错配分布呈钟形曲线，与种群扩张和空间扩张模型无显著偏离，而与稳定种群模型显著不同。R2检验检测到温和型株系的种群增长（R2 = 0.05；P = 0.01），而历史性甜菜株系（R2 = 0.10；P = 0.41）、LH71（R2 = 0.12；P = 0.37）和SpCT（R2 = 0.09；P = 0.08）均未检测到显著种群增长。结果表明温和型但非严重型BCTV株系发生了空间种群扩张。
BCTV基因的选择压力分析
非重组非重叠区C1（Rep）和V1（CP）基因未检测到任何位点或分支的正选择，C1基因85%的密码子处于强纯化选择（ω < 1），V1基因97%的密码子处于强纯化选择，反映了Rep在病毒复制和CP在病毒粒子组装、植物内长距离移动和媒介传播中的必需功能。对三个重叠基因编码区（V2/V3、V1/V2、C1/C4）的OLGenie分析显示所有重叠区ω < 1，但约束强度不同：V1和C1基因受到更强的进化约束，而C4基因约束较弱（ω = 0.55；P = 0.009）。核苷酸熵模式显示C1第三密码子位点和C4第二密码子位点具有最高的替代率，与C1保守而C4相对松弛的进化模式一致。C4蛋白的无序倾向（IDT）分析显示，BCTV C4蛋白整体IDT（80%）显著高于Rep蛋白对应区域（18%）。更引人注目的是，温和型株系C4蛋白几乎完全无序（99%），而严重型株系仅为44%（P = 3.5 × 10?8）。RELAX检验检测到C4基因末端分支上选择约束的显著松弛（k = 0.47，P < 0.05），分支位点模型仅在标记为“温和”的分支上检测到多样化选择（LRT = 5.15；P = 0.02），而“严重”分支未检测到（LRT = 2.15；P = 0.113）。这些发现表明，C4基因相对较弱的进化约束提供了更大的进化灵活性，使得适应性氨基酸替换得以积累。
五、讨论与结论
2013年加工番茄CTD流行并非由新出现的高毒力株系引起，而是由温和型（CO和Wor）和严重型（LH71和SpCT）株系共同导致的偶发性溢出病害，历史性严重型甜菜株系CA/Logan和Svr已消失。株系流行率随年份和地点变化，体现了CTD的不可预测性。温和型株系（主要是CO）在加工番茄、瓜类和大麻CTD中的主导地位与其他州的报道一致，这种株系更替与甜菜种植减少相吻合，表明寄主对BCTV株系有强烈影响。BCTV的演化涉及高突变率（1.8 × 10?4 s/s/y）导致的遗传漂变和广泛重组，四个保守重组断点允许高效的模块化基因组演化。株系间重组在所有株系中普遍存在，混合感染（杂草中约30%、加工番茄中约6%）为重组提供了大量机会。杂草储源库中约30%的无症感染率和较高的混合感染率表明，杂草寄主为BCTV株系重组和寄主适应提供了重要场所，无症表型和较低病毒滴度可能反映了向减毒致病性的共演化，有利于BLH越冬、春季繁殖和病毒获取。
BCTV约750年前从侵染NW非栽培植物的古老单组分双生病毒涌现，NW起源得到以下证据支持：另外两个Curtovirus属物种（HCTV和SpSCTV）均发生于北美；BCTV与在美国西南部和墨西哥无症仙人掌中检测到的重组双生病毒Opuntia virus 1（OpV1）存在演化关系；BCTV与HCTV/SpSCTV的C4基因分别与OpV1和OpV2的C4基因最相近。辣椒在BCTV涌现中发挥了重要作用：辣椒是所有BCTV株系（除SpCT外）最接近的推断祖先寄主；多个株系首次在辣椒中发现；侵染辣椒的株系位于三个BCTV进化枝的基部；墨西哥辣椒地方品种中的CTD抗性表明BCTV与辣椒存在共演化。19世纪末甜菜在半干旱美国西部的引入和集约化种植驱动了BCTV的涌现和多样化，甜菜既高度易感又适合BLH高效繁殖，将CTD转变为流行性病害。甜菜也是病原传播的最重要枢纽，促进了寄主范围扩张。随后甜菜种植的减少使BLH繁殖重新转向谷地OW和NW杂草，CTD重新成为NW作物的溢出病害。
BCTV的NW起源推断存在多食性本土叶蝉媒介，而C. tenellus属具有OW（地中海地区）起源，但近期研究表明NW C. tenellus种群嵌套在一个大型地中海谱系内，可能包含多个遗传上不同的进化枝甚至不同物种，因此C. tenellus可能在甜菜引入前很久就已存在于美洲。
温和型株系的优势地位涉及寄主适应。BCTV系统发育与寄主植物种类之间存在强且高度显著的关联，温和型株系具有种群增长和地理扩张的证据，而严重型株系无此特征。C4效应蛋白的差异可能是寄主适应的关键：温和型株系C4几乎完全无序（99%），而严重型株系仅44%。更无序的C4具有不同的短线性基序（SLiM）和分子识别特征（MoRF），能与更多样的寄主和病毒伙伴互作，促进寄主适应。RELAX检测到C4末端分支选择约束的显著松弛，分支位点分析仅在温和型分支检测到多样化选择，表明松弛的纯化选择伴随适应性演化，这种“松弛后适应”模式常见于寄主-病原互作蛋白。C4蛋白通过结合CLAVATA相关受体样激酶和Pep1受体、干扰RNA指导的DNA甲基化、与参与免疫信号的受体样激酶互作等方式抑制寄主抗病毒防御。NW作物和大麻虽不适合BLH繁殖，但BLH的多食性取食行为使其能够传播BCTV，这些作物并非BCTV的死端寄主，而是施加了选择压力和传播瓶颈，有利于温和型株系。
综上所述，BCTV约在750年前从侵染NW非栽培植物的古老单组分双生病毒涌现，可能通过本土叶蝉（可能是NW C. tenellus种群）传播，NW是Curtovirus属的起源中心。BCTV的演化由广泛的模块化重组、遗传漂变和农业实践（包括NW作物驯化、OW作物甜菜的引入和集约化种植、山麓地带过度放牧）共同驱动。近期向NW作物和大麻的转变与温和型BCTV株系的寄主适应和快速种群扩张相关，可能由高度无序的C4效应蛋白介导。该研究揭示了农业实践、病毒遗传灵活性和多食性媒介在植物病害涌现和持续中的关键作用。研究也存在局限性，部分株系序列数量少、地理分布不明确、采样偏向甜菜和番茄，未来需要加强对非栽培寄主中BCTV基因组的测序以验证研究结果的稳健性。
