《PLOS Computational Biology》：A joint mixture Tobit method with latent microbial abundance improves detection of microbiome–disease associations in zero-inflated data
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零膨胀（zero inflation）是微生物组差异丰度分析（differential abundance analysis, DAA）中的一项重大挑战，常常导致I型错误率膨胀或统计功效降低。尽管已有众多方法被提出以处理过量零值，但许多现有方法并未明确区分不同
零膨胀（zero inflation）是微生物组差异丰度分析（differential abundance analysis, DAA）中的一项重大挑战，常常导致I型错误率膨胀或统计功效降低。尽管已有众多方法被提出以处理过量零值，但许多现有方法并未明确区分不同的零值产生机制，而基于删失（censoring）的建模视角在微生物组数据分析中仍相对未被充分探索。为推进该领域的方法学发展，研究人员引入了一种新颖的基于删失的建模视角用于微生物组差异丰度分析。具体而言，研究人员开发了一种联合混合Tobit（joint mixture Tobit, joint mTobit）方法，用于处理零膨胀的微生物组数据。该模型在混合Tobit（mixture Tobit）公式的基础上，纳入一个点质量（point-mass）分量以表示结构性零值（structural zeros），同时通过Tobit回归分量对潜在微生物丰度进行建模。所提出的框架在统一的概率模型内联合关联疾病状态、潜在真实微生物丰度及相关协变量，从而能够适当调整混杂因素并促进更可靠的统计推断。通过显式建模观测计数背后的潜在丰度，joint mTobit方法在零膨胀条件下改善了估计稳定性并增强了检测功效。广泛的模拟研究表明，joint mTobit方法在多种设置下实现了有效的I型错误控制，同时保持了较高的统计功效和稳定的系数估计。将其应用于真实世界的结直肠癌（colorectal cancer, CRC）和腺瘤微生物组数据集，进一步展示了其识别具有生物学意义的差异丰度分类单元的能力。总体而言，这项工作为零膨胀微生物组数据开发了一种joint mTobit建模框架，使得能够对潜在微生物丰度进行推断，并为差异丰度分析中研究疾病-微生物组关联提供了基于删失的统计框架。
一、研究背景与问题
人类微生物组是指栖息于人体内的微生物群落，对宿主健康、免疫功能、代谢及疾病防御至关重要。微生物失衡（dysbiosis）已被证实与肥胖、糖尿病、炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）及结直肠癌（colorectal cancer, CRC）等多种疾病相关。差异丰度分析（differential abundance analysis, DAA）旨在识别不同条件或组别（如健康组与疾病组）间微生物丰度的显著差异，是微生物组研究中的关键任务。
16S rRNA基因测序和全宏基因组鸟枪法测序等生物测序技术可量化微生物特征，形成微生物丰度表。然而，这些丰度表往往包含大量零测量值。这些零值的产生并非总是反映真实的生物学缺失：低丰度分类单元可能在生物学上存在，但因随机采样效应、组成约束或有效检测阈值而未被观测到，从而产生不代表真实缺失的观测零值。因此，直接依赖观测零值可能掩盖罕见但疾病相关的分类单元，降低检测疾病-微生物组关联的功效。
现有处理过量零值的方法主要分为两类：一类是将零值替换为小的非零伪计数（pseudo-counts），但这会人为引入偏差，且伪计数的合适量级难以确定；另一类是使用两部分模型（two-part models），如零膨胀回归模型和障碍模型（hurdle models），这些方法虽能区分结构性零值与采样零值，但未考虑观测零值背后的潜在真实丰度，可能导致统计功效的部分损失。
本研究提出一种新颖视角：将微生物组数据中的采样零值解释为低丰度生物标志物受检测限（limit of detection, LOD）约束而产生的左删失（left-censored）观测。传统Tobit模型虽能处理删失连续结局，但假设所有零值均源于测序深度不足，无法完全解释众多分类单元的情况。与标准Tobit模型相比，混合Tobit模型（mixture Tobit model）在零处纳入一个固定概率的点质量，能够同时捕获结构性零值和采样零值。此外，研究人员采用联合建模（joint modeling）方法的估计策略，同时处理微生物组、疾病状态及其他协变量之间的关系，从而能够在潜在真实微生物丰度层面建立与疾病状态的关联，这是现有DAA方法尚未解决的方面。
二、研究内容与结论
研究人员开发了一种联合混合Tobit（joint mTobit）方法，用于零膨胀微生物组数据的差异丰度分析。该方法通过点质量分量表示结构性零值，通过Tobit回归分量对潜在微生物丰度建模，并在统一概率模型内联合关联疾病状态、潜在真实微生物丰度及相关协变量。模拟研究和真实数据应用表明，joint mTobit方法在零膨胀条件下实现了有效的I型错误控制、高统计功效和稳定的系数估计，能够识别具有生物学意义的差异丰度分类单元，为研究疾病-微生物组关联提供了基于删失的统计框架。
三、主要关键技术方法
研究人员使用的主要技术方法包括：混合Tobit模型（mixture Tobit model）用于区分结构性零值和采样零值；广义线性模型（generalized linear model）用于关联关键参数与协变量；联合建模（joint modeling）框架用于同时处理微生物丰度、疾病状态和协变量关系；最大似然估计（maximum likelihood estimation）结合Nelder-Mead算法进行数值优化；sandwich协方差估计器计算标准误；Wald统计量进行统计推断。模拟研究采用参数模拟（Simulation 1）和基于真实数据模板的SIMBA框架模拟（Simulation 2），其中Simulation 2使用Feng等[21]的CRC数据集和IBD数据集作为经验模板。真实数据应用使用Feng等[21]提供的CRC和腺瘤数据集，包含46例CRC患者、47例腺瘤患者和61例健康对照，共605个微生物物种。
四、研究结果
4.1 Simulation 1中的I型错误与功效分析
在Simulation 1中，研究人员将joint mTobit方法与CAMP、joint Tobit方法及两种传统logistic回归方法进行比较。结果显示，joint mTobit方法在所有模拟组合中保持最接近名义水平的I型错误率且稳定性最佳。相比之下，joint Tobit方法在所有组合中均表现出显著的I型错误膨胀，在n=200、w=10%、删失率=30%时甚至超过0.3。在功效评估中，joint mTobit方法在所有非暴露率和删失率组合下均一致地实现最高且最稳定的功效，n=200时功效约为0.8至0.9。joint Tobit方法虽在某些场景显示较高经验功效，但需结合其膨胀的I型错误率进行谨慎解读。此外，joint mTobit方法的功效随效应量增加而提高，样本量达到200时逐渐接近1。
4.2 Simulation 1中的点估计与区间估计结果
研究人员报告了joint mTobit方法在真实系数为0的设置下对系数的估计性能。结果显示，joint mTobit方法在偏差控制方面表现优异，特别是在较高删失率下偏差接近零（如n=200、w=20%、删失率=20%时偏差为-0.0007）。覆盖概率（coverage probability, CP）在样本量达到200时始终接近0.95，均方误差（MSE）、平均标准误（ASE）和经验标准差（ESD）保持低且稳定水平。随样本量增加，方法性能进一步提升。
4.3 Simulation 2中的I型错误与功效分析
在基于IBD和CRC数据集模板的Simulation 2中，joint mTobit方法在四种设置下保持平均I型错误率接近名义水平0.05，范围从0.045至0.059。joint Tobit方法在所有四种设置中均显示显著I型错误膨胀，平均率范围为0.132至0.183。在统计功效方面，joint mTobit方法在两个数据模板和样本量下均一致实现最高功效，n=100时平均功效为0.576至0.600，n=200时增至0.761至0.819。logistic1方法在竞争方法中功效最高，而CAMP方法功效最低。
4.4 CRC和腺瘤数据集的应用
将方法应用于Feng等[21]的数据集，在去除90%以上受试者零计数的物种后保留249个分类单元进行分析。在CRC与健康对照的比较中，joint mTobit方法经BH校正后识别出19个差异丰度分类单元，包括已知的CRC相关分类单元如Peptostreptococcus stomatis、Veillonella dispar，以及健康相关物种如Propionibacterium freudenreichii和Eubacterium hallii。在腺瘤与健康对照的比较中，识别出21个差异丰度物种，包括Bacteroides fragilis、V. dispar、Bacteroides faecis等。在CRC与腺瘤的比较中，识别出多个显著差异分类单元，包括Fusobacterium nucleatum、P. stomatis、Clostridium bolteae等。Q-Q图分析表明，joint mTobit方法在大p值处紧密遵循预期零分布，在小p值处显示明显向上偏离，反映了其改进的检测功效和有效的假阳性率控制。
五、讨论与结论
讨论部分指出，joint mTobit方法通过显式区分结构性零值和采样零值，并在潜在真实微生物丰度层面建立与疾病状态的关联，有效解决了零膨胀数据中I型错误膨胀和功效损失的问题。与现有方法相比，该方法在保持I型错误控制的同时实现了更高的统计功效。研究结论表明，joint mTobit建模框架能够对潜在微生物丰度进行推断，为差异丰度分析中研究疾病-微生物组关联提供了基于删失的统计框架，强调了在微生物组-疾病关联研究中考虑不同零值产生机制和建模潜在微生物丰度的重要性。
