PatA、GabT与IlvE的底物特异性分歧决定大肠杆菌中Nε-羧甲基赖氨酸及其代谢物N-羧甲基尸胺的分支转氨作用

《Food Chemistry》：Divergent specificity of PatA, GabT, and IlvE defines the branched transamination of N ε-carboxymethyllysine and its metabolite N-carboxymethylcadaverine in Escherichia coli

　　

- 大肠杆菌（Escherichia coli）通过转氨作用从N^ε-羧甲基赖氨酸（CML）获取氮。
- 鉴定出作用于CML与羧甲基尸胺（CM-Cad）的特异性转氨酶。
- 对酶促反应的代谢产物进行了结构鉴定。
- 体外表征了转氨酶的底物混杂性。
- 体内确认了该氮同化途径的必要性。

**论文解读：大肠杆菌中CML与CM-Cad的分支转氨代谢网络**

**研究背景与问题**

美拉德反应是食品热加工过程中还原糖与氨基化合物之间发生的一系列非酶促反应，其终产物包括多种高级糖基化终末产物（AGEs）。其中，N^ε-羧甲基赖氨酸（CML）长期被用作评估食品热处理强度的稳定标志物。CML广泛存在于烘焙食品（0.8–61.6 mg/kg）、加热肉类（1.0–423.9 mg/kg）和谷物（7.6–54.2 mg/kg）中，人体每日暴露量最高约24.6 mg。由于CML在小肠中吸收不良，大部分会进入大肠；已有研究显示约30%摄入的CML以原形从粪便排出，其余部分的代谢归宿尚不清楚。近年来，肠道微生物对食品加工来源氨基酸的代谢转化受到关注，但对CML这类糖化氨基酸的微生物分解酶学基础仍几乎空白。研究人员此前鉴定出大肠杆菌鸟氨酸脱羧酶SpeC可混杂催化CML脱羧生成N-羧甲基尸胺（CM-Cad），但ΔspeC突变体仍保留部分CML氮利用能力，提示存在后续转氨酶步骤；而当时催化CML和CM-Cad转氨作用的具体酶完全未知。基于此，本研究提出假设：大肠杆菌中负责支链氨基酸、鸟氨酸或相应生物胺代谢的转氨酶可能通过底物混杂性接受CML或CM-Cad作为非天然底物。

**研究内容与意义**

研究人员结合体外生物化学、体内突变体分析与分析化学手段，鉴定出PatA、GabT和IlvE三种转氨酶构成的分支转氨网络：PatA和IlvE催化CML直接转氨，PatA和GabT催化CM-Cad转氨，产物均为l-谷氨酸和相应的羰基中间体。该研究首次从酶学层面完整阐释了CML降解网络中氮释放的关键步骤，将饮食CML经肠道菌群转化与体内可检测的代谢物（如CM-Pip）联系起来，并扩展了“地下代谢”概念在食品加工来源修饰氨基酸分解中的作用。论文发表在《Food Chemistry》。

**主要技术方法**

研究人员从大肠杆菌MG1655基因组中扩增并克隆了8个候选转氨酶基因（argD、aspC、astC、gabT、ilvE、patA、puuE、tyrB）至pBAD24载体，表达C端His标签蛋白并经Ni²⁺亲和层析和尺寸排阻色谱（SEC）纯化。采用Glutamate-Glo?发光法以α-酮戊二酸为氨基受体、磷酸吡哆醛（PLP）为辅因子进行体外活性筛选；利用HPLC-MS/MS和UHPLC-TOF-MS对产物进行定量与结构鉴定。体内实验使用Keio collection单基因缺失菌株（大肠杆菌BW25113背景）以及通过Red/ET同源重组构建的ΔgabTΔpatA双缺失突变体，在M9最小培养基中以CML为唯一氮源进行生长表型分析。

**研究结果**

**（一）单基因缺失突变体未呈现明显生长表型**

在CML为唯一氮源的M9培养基上，argD、aspC、astC、gabT、ilvE、patA、puuE、tyrB各自的单缺失突变体均未表现出显著生长缺陷，代谢谱亦无显著变化。这与ΔspeC突变体的清晰表型形成对比，提示大肠杆菌转氨酶网络存在功能冗余，单一酶缺失可被其他成员补偿。

**（二）体外筛选鉴定出三种具有混杂活性的转氨酶**

以Glutamate-Glo?发光法测定8种纯化转氨酶对CML、CM-Cad及各自天然底物的活性，结果发现：IlvE和PatA能以CML为底物，比活力分别为0.009和0.015 μmol·min^-1·mg^-1；PatA和GabT能以CM-Cad为底物，比活力分别为0.014和0.008 μmol·min^-1·mg^-1。PatA是唯一同时接受CML和CM-Cad的转氨酶，表现出最强的底物宽泛性。其余候选酶对CML和CM-Cad的活性均接近检测阈值，而所有酶对天然底物的活性在0.4–0.6 μmol·min^-1·mg^-1范围，表明混杂活性远低于天然活性。

**（三）转氨产物的结构鉴定**

经24小时孵育后，HPLC-MS/MS分析显示：CML转氨反应中可检测到DNPH衍生的线性中间体CM-AOHA，以及未经衍生化即能检出的环化脱水产物羧甲基四氢吡啶甲酸（CM-THPA）；CM-Cad转氨反应中可检测到由线性中间体CM-APL环化形成的CM-Pip。CM-THPA的结构推断基于其与CM-Pip碎片谱相差44 Da（羧基）的特征性裂解关系，例如两者均可从羧甲基部分丢失HCOOH，分别产生m/z 96（CM-Pip）和m/z 140（CM-THPA）的碎片离子。需说明的是，DNPH衍生化仅能提供定性分析，线性中间体与环状产物之间的平衡关系尚待合成标准品后进一步明确。

**（四）ΔgabTΔpatA双缺失突变体完全丧失CML氮利用能力**

由于ilvE缺失将导致异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸营养缺陷，无法在CML为唯一氮源的严格生长实验中评估，因此体内表型分析仅聚焦于ΔgabTΔpatA双突变体。结果显示：野生型菌株在10 mM CML为唯一氮源时可正常生长，而双突变体在48小时内完全停止生长（p = 0.0060）；以NH₄Cl为氮源时双突变体与野生型生长一致。这证明GabT和PatA在体内功能冗余但共同必需，且不存在其他可补偿的替代转氨途径。

**讨论总结**

本研究解析了大肠杆菌从AGEs产物CML中同化氮的关键酶学步骤。结合此前发现的SpeC脱羧酶，CML可通过“脱羧—转氨”和“直接转氨”两条支路进入中心氮代谢；GabT、PatA与体外条件下的IlvE共同构成功能冗余的分支转氨网络。CM-Pip此前已在人尿中被检出且浓度高于其前体CM-Cad和下游产物CM-APA，本研究为此提供了明确的生化形成机制。与果糖赖氨酸由frl操纵子介导的专门化高效分解代谢不同，CML代谢依赖酶混杂性驱动的低通量地下代谢；这种策略可能允许肠道细菌在无需额外基因投资的情况下，持续利用低丰度但结构特殊的食品加工来源氨基酸，与高流量专门代谢形成生态功能互补。体内实验进一步表明，同时缺失gabT和patA会造成CML氮利用的完全阻断，说明该转氨网络是CML来源氮同化所必需的门户。研究局限性包括：IlvE因营养缺陷无法进行体内贡献评估；CM-APA在纯酶反应中未检出（检测限300 nM，约相当于母体胺0.01%的转化率），提示其形成可能需要额外的细胞酶（可能为脱氢酶）参与；线性羰基中间体与环化产物的相对比例和平衡尚无法定量。

**研究结论**

研究人员通过体外生化与体内遗传学相结合的方法，证明PatA、GabT和IlvE的混杂转氨活性构成大肠杆菌N^ε-羧甲基赖氨酸氮同化的分支转氨网络；其中GabT和PatA在体内对CML氮利用功能冗余且共同必需。该研究揭示了地下代谢在食品加工来源氨基酸降解中的扩展作用，为理解糖化蛋白饮食对肠道微生物功能及宿主健康的影响提供了分子机制框架。