南瓜（Cucurbita spp.）雄花多平台代谢组学：LC–HRMS、GC–MS 与 1H NMR 整合解析代谢特征与品种差异

《Food Chemistry》：Metabolomic profiling of pumpkin ( Cucurbita spp.) male flowers using integrated LC–HRMS, GC–MS and 1H NMR

　　

研究人员采用液相色谱高分辨质谱（LC–HRMS）、气相色谱质谱（GC–MS）与质子核磁共振（1H NMR）相整合的非靶向代谢组学策略，对南瓜（Cucurbita spp.）雄花开展代谢轮廓分析。多平台方法共注释151种代谢物，其中LC–HRMS、GC–MS与1H NMR分别贡献不同化学类别覆盖，跨平台重叠有限，说明正交平台可提升植物复杂基质中代谢物注释置信度。研究人员发现，基因型是驱动南瓜雄花代谢组分化的主导因素，四个品种在初级代谢物、苯丙素类、类黄酮、脂肪酸及氧化脂质等类别上呈现显著差异；而种植床位置（边缘与中央）对整体代谢组成影响可忽略。该结果说明南瓜雄花作为被低估的农业资源，其化学多样性主要由遗传背景决定，栽培微区位因素在本研究条件下不构成主要变异来源，为多平台植物食品代谢组学研究与功能性成分挖掘提供了方法学证据与品种资源依据。

研究背景方面，全球对营养与可持续食品原料的需求上升，南瓜（Cucurbita spp.）雌雄花中雄花产量大、常被摘除或闲置，是家庭农业中具有潜力的未充分利用资源。已有研究多关注果实，雄花化学组成尤其跨品种、跨平台系统代谢信息不足，限制了其功能成分评价与加工利用。研究人员因此以巴西伯南布哥州Agreste地区四个农艺重要南瓜品种为对象，用正交分析平台比较代谢差异，并检验种植床位置是否影响代谢组。

关键技术方法方面，样本来自Active Germplasm Bank提供的四个Cucurbita品种，其中C. moschata三种、C. maxima一种，移栽至联邦农村大学种植床，按边缘与中央分区采样并制备混合生物样本。研究人员采用液相色谱高分辨质谱（LC–HRMS，电喷雾正/负离子模式）、气相色谱质谱（GC–MS，硅烷化衍生）与质子核磁共振（¹H NMR）三类平台；LC–HRMS数据经MS-DIAL处理并接入GNPS进行特征分子网络（FBMN）分析，GC–MS用保留指数与谱库注释，¹H NMR用Chenomx进行代谢物注释；统计上经质量控制过滤、总离子流归一化、对数转换与Pareto scaling后做主成分分析（PCA）、Kruskal–Wallis与Dunn事后检验，并用Hedges' g估计效应量，通路富集以Arabidopsis thaliana的KEGG为背景。

3.1. Metabolic profiling

研究人员通过LC–HRMS、GC–MS与¹H NMR获得广覆盖代谢轮廓，三平台共注释116种代谢物，去重后111种唯一注释，叠加GNPS分子网络补充MS level 3注释后总计151种。LC–HRMS主要覆盖苯丙素类、类黄酮与脂肪酸酰基；GC–MS适合糖与有机酸热稳定衍生物；¹H NMR可重复检测氨基酸、糖与有机酸等丰量初级代谢物。ClassyFire分类显示有机氧化合物、脂肪酸酰基与苯丙素类最突出，通路富集指向乙醛酸与二羧酸代谢、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、丙酮酸代谢、苯丙素生物合成与不饱和脂肪酸生物合成。

3.2. Feature-based molecular networking on GNPS

研究人员将LC–HRMS数据接入GNPS做特征分子网络，正离子模式聚类更清晰。网络中包含萜类、脂肪酸、羟基肉桂酸、内酯与类黄酮等簇；研究人员据余弦得分、保留时间、峰形与碎片离子将部分特征标注为MS level 2或MS level 3，并总结各类别特征中性丢失：羟基肉桂酸常见CO、HCOOH、CH₃OH丢失，萜类常见H₂O、CO、CH₃COOH丢失，内酯表现水、甲醇、乙酸与CO顺序丢失，脂肪酸酰基表现H₂O、CO₂、CH₃COOH丢失及酰基/烯丙基离子，从而提升未知植物代谢物结构推断可靠性。

3.3. Analytical quality assessment

研究人员用PCA观察QC样本分布，LC–HRMS的QC紧密聚于中心，控制图显示25小时批次稳定；GC–MS无混合QC，但以十七酸与胆固醇内标CV分别10%与15%低于阈值；¹H NMR以TSP为参考，信噪比CV为11.6%，积分与浓度CV很低，半高峰宽0.68±0.08 Hz，说明三平台数据质量满足非靶向代谢组学要求。

3.4. Metabolite variability among pumpkin flower varieties

研究人员通过PCA与单变量分析发现品种是主要变异来源。C. maxima地方种与商业C. moschata明显分离，β-胡萝卜素强化C. moschata与地方C. moschata存在重叠。糖类中商业种果糖更高、部分己糖衍生物更低；氨基酸中C. maxima地方种GABA、丙氨酸、谷氨酸较低而甲硫氨酸较高；酚类中C. maxima地方种daidzin、chrysoeriol等更丰富；氧化脂质中9-HODE与壬二酸在C. maxima地方种更高；核苷酸中AMP、尿嘧啶、腺苷、NAD⁺等品种间差异显著；有机酸中乌头酸、琥珀酸也具品种特异性。结论为南瓜雄花代谢多样性主要由基因型决定。

3.5. Assessment of the influence of plant bed position on the metabolic profile of pumpkin flowers

研究人员将种植床边缘与中央样本分别做PCA，LC–HRMS、GC–MS与¹H NMR中两组高度重叠，PC解释率虽因平台而异，但均无按位置分离趋势，说明种植床位置对南瓜雄花代谢组影响可忽略。

讨论部分总结如下：研究人员指出三平台互补显著扩展了化学空间，LC–HRMS覆盖半极性次生代谢物，GC–MS覆盖挥发性与热稳定衍生物，¹H NMR提供丰量初级代谢物高重现轮廓。跨平台低重叠反映南瓜花基质复杂，也证明多平台策略必要。品种间差异主要体现在氮代谢、碳水化合物、酚类与氧化脂质上，说明遗传背景塑造化学表型；边缘与中央无分离则表明本研究微环境梯度不足以改变整体代谢组。该工作为南瓜雄花作为功能食品原料、地方品种保护及植物食品多平台代谢组学方法建立提供依据。

研究结论部分译为：整合LC–MS、GC–MS与¹H NMR分析，对两个Cucurbita物种四个品种雄花作出综合化学表征，其中包括C. moschata与C. maxima各一地方品种、商业C. moschata cv. Jacarezinho，以及通过杂交选育提高果实β-胡萝卜素含量的C. moschata品种。三平台并用扩大代谢物覆盖，检测到广泛化学类别；LC–MS主要检测苯丙素类、类黄酮与脂肪酸酰基等半极性代谢物，GC–MS更有效分析糖与有机酸的热稳定衍生物，¹H NMR虽选择性较低，但可高重现表征氨基酸、碳水化合物与有机酸等丰量初级代谢物。合并三平台注释116种代谢物，去重后111种唯一注释，再结合GNPS对LC–MS数据补充40种MS level 3注释，总计151种注释代谢物。平台间仅有少数共有代谢物，凸显南瓜花基质化学复杂性及多平台策略必要性。有机氧化合物、脂肪酸酰基与苯丙素类最具代表性，类黄酮与酚酸与色素、抗氧化及传粉吸引功能一致，含氧萜类、羟基肉桂酸衍生物与脂质氧化产物则与花组织氧化代谢、挥发物形成及植物—昆虫互作相符。品种间多变量与单变量差异表明代谢变异主要依赖基因型；C. maxima地方种谷氨酸、丙氨酸与GABA低于商业C. moschata，可能反映氮代谢与GABA shunt活性差异。碳水化合物中葡萄糖与果糖是C. moschata和C. maxima主要区分物。种植床位置未引起明确代谢分离，说明本研究条件下微区位不是主要变异来源。该研究支持南瓜雄花作为未充分利用农业资源在营养与功能成分开发中的潜力。