LysM谱系Hmgb1缺失小鼠中系统性脂多糖诱导的组织特异性炎症反应

《Brain, Behavior, & Immunity - Health》：Tissue-Specific Inflammatory Responses to Systemic LPS in Mice with LysM-Lineage Hmgb1 Deletion

　　

： 系统性炎症可影响中枢神经系统（central nervous system, CNS），即使起始刺激源于脑外。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）作为革兰阴性菌外膜成分和病原体相关分子模式，常被用于研究这种外周至中枢的通讯。研究人员既往工作表明，单次腹腔注射5 mg/kg LPS后，循环HMGB1及部分CNS炎症改变在7天时仍可检测到。本研究基于该3小时和7天LPS模型，探讨LysM表达细胞中条件性Hmgb1缺失是否改变循环HMGB1水平及不同组织区室的炎症反应。研究采用HMGB1fl/fl LysM-Cre+小鼠及同窝对照，评估血浆HMGB1、中脑炎症转录本、颈淋巴结（cervical lymph nodes, CLNs）及外周免疫器官转录反应、脉络丛CD45免疫反应性，以及Y迷宫行为表现。结果显示，LPS在3小时和7天均升高血浆HMGB1，但基因型间无显著差异。LysM谱系Hmgb1缺失在3小时和7天改变中脑部分炎症转录本表达，并修饰CLN急性转录反应。7天时外周器官反应对基因型依赖性有限。LPS增加脉络丛CD45免疫反应性，但无显著基因型效应。这些发现表明，LysM谱系Hmgb1缺失相关的炎症反应具有组织区室和时间依赖性特征。

一、研究背景与科学问题

系统性炎症可通过多种途径影响中枢神经系统功能，即使炎症起始刺激源于外周组织。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）作为革兰阴性菌外膜的主要成分和病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP），通过激活Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）受体复合物，可快速诱发外周细胞因子反应和急性疾病行为，并伴随中枢神经系统内的炎症信号传导。在较高剂量下，系统性LPS可产生实验性内毒素血症，并再现脓毒症相关系统性炎症的部分特征。尽管LPS急性反应已被充分表征，但既往研究显示，单次5 mg/kg腹腔注射LPS后，循环高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box 1, HMGB1）及部分中枢神经系统炎症改变在7天时仍可检测到，而此时急性外周炎症反应已基本消退。

HMGB1是一种高度保守的核DNA结合蛋白，参与染色质组织和转录调控。当被活化、应激或损伤细胞释放至胞外时，HMGB1作为损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern, DAMP），通过Toll样受体和晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products, RAGE）等受体放大炎症信号。早期胞外HMGB1可能反映预先存在的胞内蛋白释放，而后期升高则可能源于受刺激免疫细胞的主动分泌和损伤或死亡细胞的被动释放。在系统性炎症过程中，单核细胞、巨噬细胞和粒细胞可释放HMGB1，但免疫和非免疫细胞群可能共同构成循环HMGB1池。此外，HMGB1的作用可能取决于其释放或作用的组织环境，单纯循环浓度不足以描述其区室特异性功能。

基于此，研究人员采用既往建立的HMGB1^fl/fl LysM-Cre⁺条件性敲除模型和3小时/7天LPS范式，系统探讨LysM谱系Hmgb1缺失如何影响急性及后期对单次系统性LPS攻击的反应。通过同时比较中枢、淋巴、屏障相关及系统性区室在急性和后期时间点的反应，研究旨在确定LysM谱系Hmgb1缺失的效应是否依赖于组织环境和系统性免疫激活后的时间。

二、主要技术方法

研究人员使用雄性HMGB1^fl/fl LysM-Cre⁺小鼠（LysM表达细胞中条件性Hmgb1缺失）及HMGB1^fl/fl LysM-Cre^-同窝对照小鼠，于7-8周龄时接受单次腹腔注射LPS（5 mg/kg）或生理盐水。样本在3小时（急性期）和7天（后期）采集。主要技术方法包括：酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测血浆HMGB1和IL-1β浓度；实时定量逆转录PCR（quantitative reverse-transcription PCR, qRT-PCR）检测中脑炎症相关基因表达；NanoString nCounter基因表达分析系统检测颈淋巴结、骨髓、脾脏和肝脏的转录组反应；免疫荧光染色结合荧光显微镜定量分析脉络丛CD45免疫反应性；Y迷宫自发交替任务评估工作记忆和探索活动。样本来源为印第安纳大学医学院动物设施，实验方案经该校IACUC批准。

三、研究结果

3.1 Y迷宫行为测试（LPS暴露后7天）

双因素方差分析显示，自发交替百分比和总移动距离均无显著的基因型主效应、处理主效应或基因型×处理交互作用。LysM谱系Hmgb1缺失在7天时未对Y迷宫表现产生可检测的影响。

3.2 循环HMGB1水平

LPS处理在3小时和7天均显著升高血浆HMGB1水平，但两种基因型间无显著差异。中脑Hmgb1 mRNA表达在两个时间点均未受处理或基因型的显著影响。该结果表明，LysM谱系Hmgb1缺失未显著改变LPS暴露后的总循环HMGB1水平。

3.3 外周和中枢细胞因子相关反应

3小时时，血浆IL-1β浓度在LPS处理后显著升高，但基因型间无差异。中脑Il1b和Tnf表达在LPS处理后显著升高，但LysM-Cre⁺小鼠中的表达显著低于对照。Cd69表达也呈现基因型依赖性差异。7天时，血浆IL-1β在LPS处理后反而显著降低。中脑Il1b、Tnf、Cxcl10、Cd69和Gzma表达均显示基因型相关差异，LysM-Cre⁺小鼠中LPS诱导的升高幅度显著低于对照。这些结果表明LysM谱系Hmgb1缺失与中脑炎症转录本改变相关。

3.4 颈淋巴结免疫转录反应

3小时时，两种基因型均表现出广泛的LPS转录反应，其中149个基因共享，136个基因仅在对照中显著调控，20个基因仅在LysM-Cre⁺小鼠中显著调控。直接比较LPS处理的基因型间差异，鉴定出7个显著差异表达基因。通路分析显示补体系统、MHC I类抗原呈递、吞噬作用、TGF-β信号和炎症小体相关通路在基因型间存在差异。3小时与7天的时间比较显示两种基因型均存在大量时间依赖性转录变化。

3.5 脾脏和肝脏转录反应（7天）

脾脏中，LPS调控了140个基因，其中105个基因在两种基因型间共享，19个仅在对照中调控，16个仅在LysM-Cre⁺小鼠中调控。LysM-Cre⁺小鼠中独特调控的基因涉及脂质代谢和炎症信号通路。肝脏中转录变化有限，仅对照中Gnb1显著下调。

3.6 脉络丛CD45免疫反应性

LPS在3小时和7天均显著增加脉络丛CD45荧光强度，但两种基因型间无显著差异。该结果表明系统性LPS暴露增加脉络丛CD45免疫反应性，但LysM谱系Hmgb1缺失未显著改变此反应。

3.7 骨髓转录反应（7天）

基因水平分析显示，对照中仅Il12a显著下调，LysM-Cre⁺小鼠中Ccr2和Ltb4r1下调，Map3k1、Bcl2l1、Hmgn1和Ccr7上调。通路z-score分析显示两种基因型中白细胞介素信号、中性粒细胞脱颗粒、MAPK信号和细胞应激反应通路均发生变化。

四、讨论与结论

本研究的核心发现是：LPS在两种基因型中均升高循环HMGB1，但总血浆HMGB1浓度在3小时和7天时均无显著基因型差异。尽管循环HMGB1浓度相当，中脑和颈淋巴结中却检测到显著的基因型相关转录差异。相比之下，7天时脾脏的后期转录反应在基因型间高度重叠，而肝脏和骨髓的基因水平反应较为有限。这些发现表明，LysM谱系Hmgb1缺失相关的炎症反应在系统性LPS攻击后因解剖区室而异。

循环HMGB1可来源于多种细胞群，包括肝细胞、内皮细胞、粒细胞和损伤组织。LysM谱系Hmgb1缺失后循环HMGB1得以维持，与多种细胞群共同构成系统性HMGB1池的模型一致。中脑炎症转录本与循环HMGB1浓度的分离表明，局部组织环境、细胞相互作用、受体可用性及其他炎症介质可能共同促成HMGB1信号相关的区室特异性效应。

颈淋巴结作为与中枢神经系统相关淋巴引流相连的免疫区室，对系统性LPS暴露表现出显著反应，且LysM谱系Hmgb1缺失与其独特的转录特征相关。脉络丛在3小时和7天均保持对系统性炎症攻击的反应性，但未检测到基因型差异。行为测试未发现7天时的Y迷宫表现差异，表明分子反应可在无对应行为表型的情况下被检测到。

综上所述，多区室分析揭示了LysM谱系Hmgb1缺失相关的炎症反应并非在各组织中均匀分布。最显著的基因型相关转录差异出现在中脑和颈淋巴结，尽管循环HMGB1浓度相当。这些结果支持一个模型：LysM谱系Hmgb1缺失相关的炎症反应受组织环境的影响，并呈现时间依赖性特征。