格列本脲治疗改善大鼠颈脊髓损伤后椎管内血容量、组织保留与功能恢复：基于对比增强超声（CEUS）的在体研究

《Brain Research Bulletin》：Glibenclamide treatment improved intraspinal blood volume, tissue sparing, and functional recovery after cervical spinal cord injury in rats

　　

急性格列本脲（glibenclamide）治疗在损伤后72小时（72-hpi）显著增加组织灌注（tissue perfusion，即血容量，blood volume），并降低白质（white matter）中的细胞死亡标志物（cell death markers）。急性格列本脲治疗在损伤后8周（8-wpi）显著减小总体病变体积（lesion size），并改善前肢功能（forelimb function）。这是首次在急性颈脊髓损伤（cervical spinal cord injury，SCI）格列本脲治疗后，使用对比增强超声（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）成像在体内（in vivo）显示血容量改善的研究。

研究背景：急性脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后继发性损伤的防治仍具挑战。尽管已有大量临床前研究和临床试验，能够带来长期功能改善的神经保护策略有限。SCI分为原发性和继发性损伤，原发性损伤由初始机械损伤导致，继发性损伤包括毛细血管破坏、出血、脊髓肿胀、水肿和炎症等。由于原发性损伤主要依靠预防，神经保护治疗主要针对组织保存和限制功能丧失。格列本脲（glibenclamide）是FDA批准药物，可阻断磺酰脲受体1-瞬时受体电位melastatin 4通道（sulfonylurea receptor 1-transient receptor potential melastatin 4 channels，SUR1-TRPM4）。急性SCI后，SUR1-TRPM4在损伤部位神经元、内皮细胞和星形胶质细胞中转录上调，导致内皮细胞单价阳离子过度内流，促进水肿和毛细血管碎裂，最终引起进展性出血性坏死（progressive hemorrhagic necrosis，PHN）。PHN加重脊髓完整性破坏，导致更大病灶和更差功能结局。格列本脲通过阻断SUR1调控的NCCa-ATP通道，减少啮齿类动物出血点出血和PHN。2015年启动的开放标签、多中心、前瞻性研究评估早期格列本脲治疗颈SCI患者，但因患者招募不足未完成。SCI后椎管低灌注已被证实，改善椎管内血流可限制继发损伤。研究人员此前利用对比增强超声（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）在啮齿类和创伤性SCI患者中可视化并量化椎管内血流，且CEUS组织灌注与功能结局和创伤后保留组织相关。因此，本研究旨在用CEUS检查格列本脲对大鼠SCI挫伤模型椎管内血流动力学的影响，并检查其对caspase-8介导细胞死亡、组织保留和长期功能结局的影响。

技术方法概要：研究人员采用雌性Long Evans大鼠（16-21周龄，Envigo Labs, Indianapolis, IN），经华盛顿大学IACUC批准。共32只随机分入急性与慢性队列：急性SCI+vehicle（N=6）、SCI+格列本脲（N=6，1只因非中线损伤剔除）；慢性laminectomy（N=7）、SCI（N=6）、SCI+格列本脲（N=7）。C5双侧挫伤200 kdyn。伤后5分钟内腹腔负荷10 μg/kg，2、4、6小时皮下400 ng。关键技术包括3D B-mode、CEUS、平面波Doppler、Definity?微泡团注、超声定位显微镜（ultrasound localization microscopy，ULM）、3D stepped CEUS、曲线下面积（area under the curve，AUC）参数图、caspase-8免疫组化、Eriochrome cyanine R/甲酚紫组织保留、前肢运动评分（forelimb motor scoring，FLS）和圆柱爪偏好测试；统计用ANOVA和Cohen’s d。

研究结果：
5.1 格列本脲治疗对血肿体积和血管结构的影响：通过3D B-mode扫描计算急性至72-hpi血肿体积倍数变化，未发现格列本脲组与SCI组间血肿体积有统计学显著差异（SCI：2.68±0.31，N=6；SCI+Glib：2.20±0.40，N=4；p>0.05；Cohen’s d=0.62）。ULM图像显示72-hpi格列本脲治疗组椎管内血管结构保留。结论为血肿体积未显著降低，但效应量中等，血管结构有保留表现。
5.2 格列本脲治疗增加血容量：通过团注造影剂和CEUS，AUC分析显示格列本脲显著增加灰质（SCI：2.08±0.33，N=6；SCI+Glib：3.67±0.65，N=5；p<0.05，Cohen’s d=1.34）和白质（SCI：1.67±0.22，N=6；SCI+Glib：2.86±0.56，N=5；p<0.05，Cohen’s d=1.19）总血容量或组织灌注。3D CEUS显示灌注缺损体积倍数变化降低但未达显著（SCI：2.83±0.37，N=6；SCI+Glib：2.38±0.21，N=5；p>0.05，Cohen’s d=0.61）。结论为格列本脲增加椎管内血容量。
5.3 格列本脲治疗降低caspase-8强度：通过caspase-8免疫组化，白质caspase-8强度显著降低（SCI：5.63×10⁸±5.69×10⁷ a.u.，N=6；SCI+Glib：4.03×10⁸±2.79×10⁷ a.u.，N=5；p<0.05，Cohen’s d=1.42），灰质未显著降低（SCI：9.52×10⁸±8.25×10⁷ a.u.，N=6；SCI+Glib：7.86×10⁸±4.63×10⁷ a.u.，N=5；p>0.05，Cohen’s d=1.10）。结论为白质细胞死亡减少。
5.4 格列本脲减少组织损伤：通过8-wpi Eriochrome cyanine R和cresyl violet染色及3D体积分析，格列本脲组总平均病变体积显著减少，额外保留2.94%脊髓体积（6.4 mm）（SCI：92.17±0.78%，N=6；SCI+Glib：95.11±0.66%，N=7；p<0.05）。结论为组织保留改善。
5.5 格列本脲治疗改善前肢功能：通过8周每周FLS和圆柱爪偏好测试，双因素ANOVA显示治疗、时间及交互作用显著。4-wpi格列本脲组FLS显著优于SCI组（SCI：10.6±1.9，N=5；SCI+Glib：17.0±1.0，N=5；p<0.001，Cohen’s d=1.83），并持续至8-wpi（SCI：13.4±1.7，N=5；SCI+Glib：18.2±0.8，N=5；p<0.05，Cohen’s d=1.57）。Laminectomy组保持最高FLS 20。4-8-wpi期间格列本脲组与laminectomy组无统计学差异，而SCI组低于laminectomy组。圆柱爪偏好测试无显著效应（p>0.05，F(1,11)=1.2，Cohen’s d=0.67）。结论为前肢运动改善，探索性前肢功能未显著改善。

讨论总结：本研究报道格列本脲对颈SCI大鼠椎管内血容量和神经保护的影响。SCI后低灌注和椎管内出血被认为影响急性和亚急性继发损伤。既往研究通过运动评分、组织学和MRI报道格列本脲神经保护作用，近期综述强调需进一步研究其血流动力学基础。本研究用CEUS在体检查血流动力学，发现格列本脲改善脊髓血容量即组织灌注，减少白质caspase-8相关细胞死亡，改善运动结局，增加组织保留。这是首个用CEUS显示大鼠颈SCI格列本脲治疗后体内脊髓血流动力学变化的研究。与既往一致，急性给药改善长期恢复。但既往在单侧SCI中显示限制椎管内出血，本研究在B-mode 72-hpi未见血肿体积显著减少。差异可能与治疗持续时间较短有关，本研究为10 μg/kg负荷，每2小时400 ng，共6小时；既往研究为10 μg/kg负荷，200 ng/h持续7天输注。差异也可能与单侧和双侧SCI及损伤严重程度有关。效应量中等提示71%治疗动物可能有意义血肿减少。CEUS在72-hpi检测到血容量改善，而功能差异到4-wpi才出现。研究人员推测CEUS高敏感性可揭示微血管流即刻变化，可能预测长期生理恢复。格列本脲抑制SUR1-TRPM4，稳定内皮完整性，限制实质出血，保留毛细血管通畅，而非诱导原发小动脉扩张。本研究中虽未显著减少实质出血，但CEUS检测到功能微血管网络保留，表现为AUC增加，提示保留血管内血容量。改善血流可能减少PHN，白质caspase-8减少支持该机制。格列本脲还可能通过胰腺胰岛素释放活性促进神经元细胞通过GLUT3摄取葡萄糖。局限性包括血肿无统计学显著限制结论；需更大样本和更长治疗；血容量与组织保留、恢复的因果未建立；未来需在同一动物中配对急性CEUS与长期功能观察；临床SCI异质，格列本脲可能对继发损伤由血容量驱动和损伤扩展的特定损伤更有效。

研究结论翻译：研究人员的研究显示，急性格列本脲治疗能够显著改善啮齿类动物中度颈脊髓损伤后微血管内的椎管内血容量（即组织灌注）、组织保留并改善恢复。CEUS是一种可靠且新颖的工具，可提供椎管内血管和血流动力学变化的重要见解。这是首项显示急性SCI中格列本脲治疗相关椎管内血容量改变证据的研究，同时显示组织保留和行为功能显著改善。