《Brain Research Bulletin》：Salidroside regulates hippocampal neuronal autophagy in ASD mice via the SIRT2/FoxO1 pathway
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红景天苷（Salidroside，SAL）可减轻丙戊酸（VPA）诱导的体内外神经元损伤。SAL能够改善自闭症谱系障碍（ASD）样行为和海马神经元损伤。SAL可恢复VPA诱导的自噬异常。SIRT2/FoxO1信号通路参与SAL介导的自噬调控。抑制SIRT2会削弱
红景天苷（Salidroside，SAL）可减轻丙戊酸（VPA）诱导的体内外神经元损伤。SAL能够改善自闭症谱系障碍（ASD）样行为和海马神经元损伤。SAL可恢复VPA诱导的自噬异常。SIRT2/FoxO1信号通路参与SAL介导的自噬调控。抑制SIRT2会削弱SAL的保护作用。本研究利用VPA诱导的ASD小鼠模型和HT22细胞损伤模型，探讨了SAL的神经保护效应及其与SIRT2/FoxO1通路和自噬的关系。结果表明，SAL发挥神经保护作用，这与SIRT2/FoxO1通路及自噬相关过程的改变有关，从而改善ASD样行为和学习记忆能力。这些发现为SAL干预ASD提供了潜在的分子靶点，并提示SIRT2/FoxO1通路可能参与了SAL的神经保护作用。
研究背景与科学问题
自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder，ASD）是一组早发性神经发育障碍，核心表现为社交缺陷、重复刻板行为和兴趣狭窄。近年来ASD患病率持续上升，已成为全球性公共卫生问题，但目前仍缺乏能直接改善其核心病理的特效药物。自噬是细胞通过溶酶体降解病原体和受损细胞器以维持内稳态的过程，其失调可能参与ASD的发生发展。Sirtuin 2（SIRT2）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性去乙酰化酶，可通过调节下游叉头框蛋白O1（FoxO1）的乙酰化水平来调控自噬。前期研究发现，ASD小鼠海马神经元发育障碍与SIRT2缺失导致的FoxO1乙酰化升高及过度自噬有关。红景天苷（Salidroside，SAL）是从高山植物红景天中提取的天然苯丙素苷单体，具有神经保护作用，且安全性高、耐受性好。已有研究表明SAL可通过SIRT1/FoxO1通路调控自噬，而SIRT2与SIRT1同属Sirtuin家族，且共享FoxO1作为调控自噬的关键下游效应分子。因此，研究人员假设SAL可能通过SIRT2/FoxO1通路调控自噬，进而改善ASD模型小鼠的海马神经元发育缺陷。
研究内容与主要结论
为验证上述假说，研究人员采用VPA诱导的HT22细胞损伤模型和孕期暴露VPA的C57BL/6J小鼠ASD模型，系统研究了SAL对ASD样行为、海马神经元形态与存活的影响，并从SIRT2/FoxO1通路和自噬调控角度阐明其分子机制。研究结果显示，SAL能显著提高VPA损伤的HT22细胞活力，改善细胞形态，减少自噬体形成。在动物实验中，SAL干预改善了VPA暴露子代小鼠的社交互动缺陷、重复刻板行为、焦虑样行为以及学习记忆能力。分子层面，SAL处理降低了自噬标志蛋白Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3（LC3）的表达，提高了自噬底物p62的水平，同时上调了神经元标志物神经元核抗原（NeuN）和微管相关蛋白2（MAP2）的表达。进一步的机制研究表明，SAL能够上调SIRT2的表达，降低FoxO1的乙酰化水平，从而抑制VPA诱导的过度自噬。而使用SIRT2特异性抑制剂AGK2（体外）或AK-7（体内）后，SAL的上述保护效应被显著削弱，表明SIRT2/FoxO1通路是SAL发挥神经保护作用的关键环节。该研究首次揭示了SAL通过SIRT2/FoxO1通路调控自噬稳态进而改善ASD样行为的分子机制，为SAL应用于ASD的临床治疗提供了重要的实验证据和理论依据。
关键技术方法
- 1.
细胞模型建立：使用2 mM丙戊酸（VPA）处理小鼠海马神经元HT22细胞24小时，建立体外神经元损伤模型。
- 2.
动物模型建立：于孕12.5天给C57BL/6J孕鼠腹腔注射600 mg/kg VPA，其子代经发育学和行为学评估确认为ASD模型。
- 3.
行为学评估：采用三箱社交实验、自我理毛实验、旷场实验和水迷宫实验分别评价小鼠的社交能力、重复刻板行为、焦虑水平和学习记忆能力。
- 4.
组织病理学检测：采用苏木精-伊红（HE）染色和尼氏（Nissl）染色观察海马CA1、CA3和齿状回（DG）区神经元形态。
- 5.
超微结构观察：利用透射电子显微镜（TEM）观察细胞自噬体等超微结构变化。
- 6.
分子生物学检测：采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫荧光染色技术检测自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3、p62）、神经元标志物（NeuN、MAP2）及通路蛋白（SIRT2、FoxO1、Ac-FoxO1）的表达水平。
研究结果
3.1 VPA诱导的细胞损伤与动物行为变化
CCK-8结果显示，VPA呈剂量依赖性地降低HT22细胞活力，2 mM VPA处理24小时使细胞活力降至约50%，因此选定此浓度建模。在动物模型中，VPA暴露子代在悬崖回避、负趋地性等发育测试中表现迟缓，体重和身长在P14和P21显著低于对照组。行为学测试显示，模型组小鼠社交指数显著下降，自我理毛时间显著增加，旷场中央区进入次数和停留时间均显著减少，证实ASD模型成功建立。
3.2 SAL对HT22细胞的影响
CCK-8安全性评估显示，SAL在实验浓度范围内对正常HT22细胞无明显细胞毒性。通过浓度梯度筛选，确定20 μM SAL为最佳干预浓度。在该浓度下，SAL将VPA损伤细胞的活力从约58%提升至约76%；而加入SIRT2抑制剂AGK2后，细胞活力进一步降至约44%。
3.3 SAL处理后HT22细胞的形态变化
HE染色显示，VPA组细胞呈短梭形、胞质染色加深；SAL处理后细胞形态趋于正常，呈长梭形、轮廓清晰。透射电镜观察显示，VPA组可见自噬体，线粒体嵴模糊减少；SAL组未见明显自噬体，线粒体结构相对完整；而AGK2加重了细胞损伤和自噬体数量。
3.4 SAL处理HT22细胞的分子分析
RT-qPCR、Western blot和免疫荧光结果一致表明：与对照组相比，VPA组Beclin-1和LC3的mRNA及蛋白表达升高，LC3-II/LC3-I比值增加，p62表达降低，表明自噬活性增强；SAL处理逆转了这些变化，降低了Beclin-1和LC3表达，增加了p62表达。同时，VPA组神经元标志物NeuN和MAP2表达降低，SAL处理使其恢复。通路分析显示，VPA组SIRT2和FoxO1表达降低，Ac-FoxO1/FoxO1比值升高；SAL处理则上调SIRT2和FoxO1，降低Ac-FoxO1/FoxO1比值。AGK2可拮抗SAL的这些效应。
3.5 SAL治疗后ASD小鼠的行为学评估
在三箱社交测试中，VPA+SAL组与陌生鼠1的互动时间较VPA组显著增加，对空笼时间减少。自我理毛测试中，SAL组理毛时长较VPA组显著缩短。旷场实验中，SAL组中央区进入次数和停留时间较VPA组显著增加。水迷宫测试中，SAL组逃避潜伏期较VPA组显著缩短，穿越平台次数显著增加。以上结果表明SAL改善了社交缺陷、重复刻板行为、焦虑和学习记忆障碍。
3.6 SAL治疗后海马形态学分析
HE和Nissl染色显示，对照组海马CA1、CA3和DG区神经元排列紧密有序。VPA组神经元排列松散，间隙增宽，尼氏体溶解减少。SAL组神经元排列较规则，间隙缩小，尼氏体数量增多。AGK2加重了神经元损伤。
3.7 SAL治疗ASD小鼠的分子分析
Western blot和免疫荧光结果与细胞实验结果一致：VPA组海马组织中Beclin-1和LC3蛋白表达升高，p62降低；SAL处理后上述指标逆转。VPA组NeuN和MAP2表达降低，SAL处理使其恢复。通路方面，VPA组SIRT2表达降低，Ac-FoxO1/FoxO1比值升高；SAL处理上调SIRT2表达，降低Ac-FoxO1/FoxO1比值。AK-7可削弱SAL的保护作用。
讨论与结论
讨论总结：本研究的讨论部分首先确认了VPA诱导的ASD模型的有效性，指出VPA可通过破坏突触传递、抑制神经发生和诱导神经炎症等机制损伤神经元，而SAL作为一种源自红景天的天然化合物，具有抗氧化、抗凋亡和调控自噬等多重药理活性。研究人员发现，SAL在安全浓度范围内无细胞毒性，并能有效改善VPA引起的细胞活力下降和形态损伤。在动物水平，SAL干预（P21-P34，50 mg/kg灌胃给药）显著改善了ASD小鼠的社交、刻板行为、焦虑及学习记忆功能。机制上，SAL通过上调SIRT2表达、促进FoxO1去乙酰化，抑制了VPA诱导的过度自噬，从而保护了海马神经元的结构与功能完整性。值得注意的是，SAL对自噬的调控呈现情境依赖性——在本研究中主要抑制过度自噬，而在某些缺血模型中则促进自噬，提示其具有维持自噬稳态的作用。此外，SAL还可能通过AMPK-NAD+轴上调SIRT2活性，这有待进一步验证。
研究结论翻译：本研究利用VPA诱导的ASD小鼠模型和HT22细胞损伤模型，探讨了SAL的神经保护效应及其与SIRT2/FoxO1通路和自噬的关系。结果表明，SAL发挥神经保护作用，这与SIRT2/FoxO1通路及自噬相关过程的改变有关，从而改善ASD样行为和学习记忆能力。这些发现为SAL干预ASD提供了潜在的分子靶点，并提示SIRT2/FoxO1通路可能参与了SAL的神经保护作用。
