《Brain Research Bulletin》：Clusterin interference decreases cerebral ischemia/reperfusion injury by suppressing TFR1-dependent ferroptosis
编辑推荐：
摘要专业翻译
缺血性脑卒中是全球范围内导致残疾和死亡的主要疾病之一。临床上，及时恢复脑血流对于挽救缺血性脑组织至关重要。然而，血流重建常导致脑缺血/再灌注（I/R）损伤。脑I/R损伤可引发血脑屏障（BBB）破坏、严重炎症反应（如IL-1β、TNF-α和IL-6
摘要专业翻译
缺血性脑卒中是全球范围内导致残疾和死亡的主要疾病之一。临床上，及时恢复脑血流对于挽救缺血性脑组织至关重要。然而，血流重建常导致脑缺血/再灌注（I/R）损伤。脑I/R损伤可引发血脑屏障（BBB）破坏、严重炎症反应（如IL-1β、TNF-α和IL-6的释放）以及不可逆的神经元死亡，显著限制了血管再通治疗的临床获益。近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种新型的铁依赖性调控性细胞死亡形式，已被证实在脑I/R损伤的病理过程中发挥关键作用。在此过程中，转铁蛋白受体1（TFR1）作为介导细胞铁离子摄取的核心膜蛋白，其异常激活会加剧细胞内铁过载。此外，以核因子E2相关因子2（NRF2）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和溶质载体家族7成员11（SLC7A11）为代表的抗氧化防御系统受损，以及脂质过氧化酶ACSL4的上调，共同加速神经元铁死亡。Clusterin是一种高度保守的应激诱导多功能糖蛋白，参与细胞凋亡、脂质转运和蛋白质稳态等多种生理病理过程。既往研究报道急性缺血性脑卒中患者血清Clusterin水平显著升高，但Clusterin在脑I/R损伤中的精确功能作用及其与神经元铁死亡之间的机制联系尚未阐明。本研究系统探讨了Clusterin在体内外脑I/R损伤模型中的调控作用，并进一步阐明其调节神经元铁死亡的分子机制。研究发现，Clusterin在体内外脑I/R损伤模型中均显著上调。干扰Clusterin通过抑制TFR1依赖性神经元铁死亡，减轻了血脑屏障破坏和炎症反应。TFR1作为Clusterin的关键下游靶点，其蛋白相互作用及挽救实验表明，TFR1过表达可逆转Clusterin敲低带来的抗铁死亡和增殖保护效应。综上所述，Clusterin/TFR1轴是调控神经元铁死亡的关键通路，为缺血性脑卒中的靶向干预提供了极具前景的新策略。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
缺血性脑卒中（ischemic stroke）是全球范围内导致残疾和死亡的主要疾病之一。临床上，及时恢复脑血流是挽救缺血性脑组织的关键手段，但血流重建往往引发脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤，导致血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）破坏、严重炎症反应以及不可逆的神经元死亡，显著限制了血管再通治疗的临床获益。因此，深入探索脑I/R损伤的分子机制并寻找有效的神经保护靶点，是当前卒中研究的迫切需求。
近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种新型的铁依赖性调控性细胞死亡形式，已被证实在脑I/R损伤的病理过程中发挥关键作用。脑I/R导致脑组织铁代谢紊乱和活性氧（reactive oxygen species, ROS）过度积累，触发严重的脂质过氧化。在此过程中，转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1, TFR1）作为介导细胞铁离子摄取的核心膜蛋白，其异常激活会加剧细胞内铁过载；同时，以核因子E2相关因子2（NRF2）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和溶质载体家族7成员11（SLC7A11）为代表的抗氧化防御系统受损，以及脂质过氧化酶ACSL4的上调，共同加速神经元铁死亡。靶向干预铁死亡通路已成为缓解脑缺血再灌注损伤极具前景的策略。
Clusterin是一种高度保守的应激诱导多功能糖蛋白，参与细胞凋亡、脂质转运和蛋白质稳态等多种生理病理过程。已有研究报道急性缺血性脑卒中患者血清Clusterin水平显著升高，且小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）后Clusterin mRNA表达进行性上调。然而，Clusterin在脑I/R损伤中的精确功能作用——特别是其在氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）诱导的神经元损伤中的调控作用——仍不完全清楚，且Clusterin与神经元铁死亡之间的机制联系尚未阐明。本研究旨在系统探讨Clusterin在体内外脑I/R损伤模型中的调控作用，并阐明其调节神经元铁死亡的分子机制。
二、研究设计与技术方法
研究人员采用体内外相结合的研究策略。体内实验使用6周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠（购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（苏）2023-0009），构建MCAO模型模拟脑缺血再灌注损伤，并通过脑立体定位仪注射Clusterin干扰腺相关病毒载体进行干预。体外实验使用小鼠海马神经元HT22细胞（购自武汉普诺赛生命科技有限公司），构建氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型。研究采用的主要技术方法包括：TTC染色评估脑梗死面积、HE染色观察脑组织病理形态、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹法（Western Blotting）检测基因和蛋白表达、酶联免疫吸附测定（ELISA）检测炎症因子水平、免疫荧光和免疫组化检测蛋白表达与分布、mRNA转录组测序分析差异表达基因、铁离子检测试剂盒及生化试剂盒检测铁离子、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平、CCK8法检测细胞活力、免疫共沉淀（Co-IP）检测蛋白相互作用。动物实验经赣州市人民医院伦理委员会批准（No. PJD2024-001-01）。
三、研究结果
3.1 Clusterin在小鼠脑缺血再灌注损伤模型中显著过表达
研究人员通过TTC染色证实MCAO组小鼠脑组织出现大面积梗死，HE染色显示MCAO组神经元结构疏松、呈网状排列、大量神经元坏死伴明显间质水肿。qPCR和Western Blot结果显示，与假手术组相比，MCAO组小鼠脑组织中Clusterin的mRNA和蛋白表达均显著升高。ELISA检测进一步证实MCAO组脑组织中Clusterin含量显著增加，免疫荧光实验也观察到MCAO组Clusterin表达上调。
3.2 干扰Clusterin减轻小鼠脑缺血再灌注损伤后的脑组织损伤
研究人员使用Clusterin干扰腺相关病毒载体对小鼠进行颅内干预。TTC染色结果显示，与sh-NC组相比，Clusterin干扰组脑组织梗死面积显著缩小，mNSS神经功能评分显著降低。mRNA转录组测序分析显示，与sh-NC组相比，sh-CLU组脑组织中有257个上调基因和383个下调基因，其中TFR1位列下调最显著的前10个基因之一。HE染色显示Clusterin干扰组细胞坏死减少、排列紊乱得到缓解。免疫组化检测发现，与sh-NC组相比，sh-CLU组脑组织中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达显著增加。ELISA检测表明，Clusterin干扰显著降低了脑组织中促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的水平。
3.3 干扰Clusterin减轻小鼠脑缺血再灌注损伤模型中的铁死亡
qPCR和Western Blot检测显示，与sh-NC组相比，sh-CLU组脑组织中促铁死亡标志物TFR1和ACSL4的mRNA及蛋白表达显著降低，而抗氧化标志物NRF2、GPX4和SLC7A11的表达显著升高。铁离子检测显示Clusterin干扰显著降低了脑组织铁离子水平。生化检测表明，Clusterin干扰降低了MDA水平并升高了GSH水平，提示脂质过氧化得到有效抑制。
3.4 Clusterin干扰对OGD/R处理的HT22细胞铁死亡的影响
体外实验中，OGD/R处理后HT22细胞中Clusterin mRNA和蛋白表达显著升高。研究人员构建了三个Clusterin干扰载体（sh-clusterin-1、sh-clusterin-2、sh-clusterin-3），其中sh-clusterin-2干扰效率最高，用于后续实验。CCK8检测显示，与sh-NC组相比，sh-clusterin组细胞活力显著升高。铁离子和MDA水平在Clusterin干扰后显著降低，而GSH水平显著升高。
3.5 Clusterin干扰对不同处理HT22细胞铁死亡相关mRNA和蛋白表达的影响
与体内实验结果一致，OGD/R处理后HT22细胞中TFR1和ACSL4表达显著升高，NRF2、GPX4和SLC7A11表达显著降低；而Clusterin干扰可显著逆转这一趋势，降低TFR1和ACSL4表达，升高NRF2、GPX4和SLC7A11表达。
3.6 TFR1过表达逆转sh-Clusterin对OGD/R条件下HT22细胞损伤的保护作用
免疫共沉淀实验证实Clusterin与TFR1在HT22细胞中存在蛋白相互作用。研究人员进一步构建TFR1过表达载体进行挽救实验。CCK8检测显示，与OE-NC+sh-clusterin组相比，OE-TFR1+sh-clusterin组细胞活力显著降低，表明TFR1过表达逆转了Clusterin敲低的细胞保护效应。qPCR和Western Blot结果同样显示，TFR1过表达逆转了Clusterin敲低对铁死亡相关标志物的调控作用，即重新升高TFR1和ACSL4表达、降低NRF2、GPX4和SLC7A11表达。
四、讨论与结论
研究讨论指出，Clusterin在中枢神经系统损伤中的作用存在争议：部分研究认为其具有分子伴侣样功能，可清除错误折叠蛋白并发挥神经保护作用；但另一些研究提示在严重氧化应激或急性缺血条件下，Clusterin的异常积累可能介导细胞凋亡甚至加速神经元坏死。本研究结果倾向于后者——在急性脑I/R损伤的特定微环境中，高表达的Clusterin发挥"促损伤"作用。研究人员提出Clusterin的作用具有情境依赖性：当其下游信号机制完好时作为内源性保护因子，而当细胞环境能量代谢严重受损、无法支持其促生存通路时，则可能促进铁死亡。
在机制层面，抑制Clusterin可显著降低Fe2?和MDA水平，下调脂质过氧化关键酶ACSL4的表达，同时上调NRF2/SLC7A11/GPX4经典抗氧化轴，恢复细胞内GSH消耗。Co-IP实验证实Clusterin与TFR1存在物理结合，TFR1过表达挽救实验确认了该信号轴的上下游关系。研究人员推测Clusterin可能通过两种潜在机制调控TFR1：一是作为辅助因子稳定TFR1的膜定位，防止其被溶酶体或泛素-蛋白酶体系统降解；二是通过构象变化促进TFR1介导的铁内吞效率。
此外，抑制Clusterin不仅减轻了神经元铁死亡，还显著上调紧密连接蛋白（Occludin、ZO-1）表达，抑制IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎因子释放。研究人员认为，受损神经元释放损伤相关分子模式（DAMPs）激活小胶质细胞和星形胶质细胞，引发强烈神经炎症，持续炎症风暴进一步破坏BBB，形成恶性循环。干扰Clusterin介导的神经保护作用可能是通过切断神经元铁死亡的"源头"，从而在宏观上平息后续炎症级联反应并维持BBB结构稳定。
研究结论：本研究揭示了Clusterin在脑I/R损伤中的新型促损伤机制。体内外实验证实，Clusterin表达增加会加剧脑组织炎症、血脑屏障破坏和神经元铁死亡；而特异性干扰Clusterin发挥了显著的神经保护作用。这一保护机制依赖于Clusterin与TFR1的直接相互作用，通过靶向抑制TFR1来减轻细胞内铁过载和脂质过氧化。综上所述，Clusterin/TFR1轴是调控神经元铁死亡的关键通路，为缺血性脑卒中的靶向干预提供了极具前景的新策略。
