GSTP1作为前列腺癌衰老相关诊断标志物的整合生物信息学与功能验证研究

《Frontiers in Oncology》：GSTP1 as a senescence-associated diagnostic candidate in prostate cancer: integrative bioinformatics and functional validation

　　

**摘要**

**背景：** 前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，具有高转移潜能和不良临床结局，目前有效的生物标志物和治疗靶点仍十分有限。

**方法：** 本研究采用多组学方法（multi-omics approach），整合转录组图谱、衰老相关基因筛选和机器学习技术，分析四个GEO数据集，以鉴定前列腺癌（PCa）的关键诊断生物标志物。

**结果：** 研究鉴定出差异表达的衰老相关基因，富集分析揭示其在PCa中的显著参与。研究人员利用机器学习算法，构建了以GSTP1为核心的稳健诊断模型，展现出较高的预测性能。GSTP1缺失驱动多种致癌表型，包括增强的增殖、迁移、侵袭能力，以及抑制细胞衰老和DNA损伤，提示GSTP1可能促进细胞衰老同时抑制恶性进展。此外，其表达与不同的免疫细胞谱相关，凸显了其在塑造PCa免疫格局中的作用。

**讨论：** 研究结果证实GSTP1作为衰老相关应激反应基因发挥作用，为前列腺癌发病机制提供了新视角，并有望推动靶向衰老和免疫关联的治疗策略。该研究为精准肿瘤学中利用衰老生物标志物提供了综合框架，并强调GSTP1是PCa管理中具有临床转化前景的候选分子。

**前列腺癌衰老相关诊断标志物GSTP1的整合生物信息学分析与功能验证**

**一、研究背景与问题提出**

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是全球男性最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的第二大原因，每年导致约37.5万人死亡。年龄是PCa最明确且最关键的独立危险因素，其发病率随年龄呈指数级增长。美国癌症统计数据显示，70岁以上男性罹患PCa的终身风险（9.0%）远高于60–69岁年龄段（1.8%），尸检研究亦证实老年男性中PCa的组织学患病率极高（70–79岁白种人为36%，非裔美国人为51%）。尽管雄激素剥夺疗法（androgen deprivation therapy，ADT）和雄激素受体通路抑制剂联合多西他赛的多种治疗方案不断进步，大多数肿瘤仍不可避免地进展为转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC），构成晚期疾病治疗的核心挑战。因此，识别与衰老通路特异相关的新型生物标志物，对于提高早期诊断准确性和开发针对这一关键风险因素的靶向治疗策略具有重大意义。

谷胱甘肽硫转移酶pi（glutathione S-transferase pi，GSTP1）在多数人类肿瘤中呈过表达状态，并与化疗耐药、肿瘤进展和不良预后相关。然而PCa呈现显著悖论：超过90%的病例中GSTP1因启动子区域高甲基化而表达沉默，且该表观遗传学失活是PCa中最常见的体细胞遗传学改变。尽管GSTP1缺失在PCa中高度普遍，但其在衰老背景下对前列腺癌变的具体功能贡献仍不完全清楚，是本领域重要的知识空白。为此，研究人员开展了本项整合多组学分析与功能验证研究。

**二、研究内容与结论概述**

研究人员采用多数据整合策略结合稳健的机器学习算法，系统鉴定并优先排序了PCa发病机制中核心的衰老相关生物标志物，证明GSTP1是与衰老通路相关的应激反应基因，并在PCa进展中发挥关键调控作用。体外功能实验表明，GSTP1缺失促进细胞增殖、迁移与侵袭，同时削弱衰老相关表型。免疫浸润分析进一步揭示了GSTP1表达水平与肿瘤微环境中多种免疫细胞组成的显著相关性。总体而言，该研究为精准肿瘤学中利用衰老生物标志物提供了系统框架，并确立GSTP1为PCa临床转化中具有前景的候选分子。

**三、关键技术与方法**

研究从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）获取四个公开微阵列数据集（GSE46602、GSE60329、GSE71781、GSE79021），经分位数标准化、平台间变异协调和批次效应校正，衰老相关基因列表来源于Aging Atlas数据库。研究使用limma包进行差异表达分析，采用clusterProfiler包进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，应用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）评估通路富集。孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析利用IEU OpenGWAS数据库以表达数量性状位点（expression quantitative trait locus，eQTL）作为工具变量。三种机器学习算法——随机森林（Random Forest，RF）、支持向量机递归特征消除（Support Vector Machine with Recursive Feature Elimination，SVM-RFE）和最小绝对收缩与选择算子（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator，LASSO）——用于核心基因筛选。免疫细胞反卷积采用CIBERSORT算法。体外实验于PC3、DU145前列腺癌细胞系及RWPE1正常前列腺上皮细胞系（均购自中国科学院细胞库）中进行，包括慢病毒介导的基因敲低、CCK-8增殖实验、Transwell迁移侵袭实验、划痕愈合实验、克隆形成实验、SA-β-gal衰老染色、免疫荧光检测及Western blot等。

**四、研究结果**

**4.1 差异表达揭示PCa中关键的衰老相关基因。** 通过limma包比较肿瘤与正常组织转录谱，共鉴定出603个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），热图和火山图清晰展示了其表达特征。GSEA结果显示黏着斑等通路显著富集。将603个DEGs与Aging Atlas数据库中衰老相关基因组取交集，识别出26个衰老相关枢纽基因，作为后续机器学习特征选择的起始候选。

**4.2 功能富集分析揭示PCa中的关键调控网络。** GO注释显示DEGs显著富集于上皮细胞增殖调控、凋亡信号调节、成骨细胞和淋巴细胞分化等生物学过程。KEGG通路分析中，PCa通路（hsa05215）最为显著。Pathview可视化显示该通路中肿瘤抑制基因GSTP1（致癌物清除受损）和p21（细胞周期进程破坏）显著下调，提示衰老相关分子机制驱动PCa进展。

**4.3 机器学习驱动的诊断枢纽基因鉴定。** LASSO回归通过十折交叉验证识别16个候选特征；SVM-RFE通过径向核优化获得最高判别准确率0.834，优先排序11个特征基因；RF以Gini重要性保留前20个特征。

**4.4 孟德尔随机化分析与核心生物标志物鉴定。** MR分析显示GSTP1相关单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与PCa风险呈负相关，漏斗图分布对称，留一法敏感性分析确认因果估计稳健性。逆方差加权（inverse-variance weighted，IVW）分析证实GSTP1为统计学显著的保护因素（比值比[odds ratio，OR]=0.901，95%置信区间[confidence interval，CI]：0.818–0.992，p < 0.05）。四种方法（MR、RF、SVM-RFE、LASSO）的Venn图交集分析显示，GSTP1是唯一被所有计算方法一致识别的基因。

**4.5 核心预后生物标志物验证。** 独立GEO数据集交叉平台分析确认GSTP1显著下调（p < 0.001）。受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析显示，GSTP1的曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.779，具备良好分类效能。决策曲线分析和校准图验证了综合风险评分的临床效用，并构建了预后列线图。

**4.6 PCa免疫微环境组成分析。** CIBERSORT算法估计22种免疫细胞相对丰度，显示PCa组织中适应性免疫普遍受抑：B细胞na?ve、浆细胞和T细胞CD8显著减少，而B细胞记忆、T细胞调节、T细胞γδ和巨噬细胞M2富集（p < 0.05）。GSTP1表达与抗肿瘤免疫组分（B细胞na?ve、浆细胞、T细胞CD8、NK细胞静息和单核细胞）正相关，与多种促肿瘤群体（B细胞记忆、T细胞CD4记忆活化、T细胞调节等）负相关，提示其在抗肿瘤免疫调控中的潜在作用。

**4.7 GSTP1缺失促进PCa细胞系增殖、转移。** 与RWPE1正常对照相比，PC3和DU145细胞中GSTP1在蛋白和mRNA水平均显著下调。短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）介导的GSTP1敲低显著增强PCa细胞增殖能力、克隆形成能力、12小时划痕愈合迁移能力（p < 0.05）以及Transwell迁移和侵袭细胞数量，表明GSTP1在PCa细胞中发挥抑癌作用。

**4.8 GSTP1促进PCa细胞系衰老进展。** 与对照相比，GSTP1敲低组SA-β-gal阳性细胞显著减少，细胞周期抑制因子p16和p21蛋白表达下调。免疫荧光检测显示，GSTP1敲低后γH2AX核灶数量及荧光强度显著降低，表明GSTP1调控DNA损伤反应和衰老表型。

**五、讨论总结与结论翻译**

讨论部分指出，GSTP1在PCa中并非经典抑癌基因——过表达实验未能抑制细胞增殖，提示其可能作为前列腺内的“管家基因”维持基因组完整性。GSTP1缺失通过表观遗传沉默使细胞获得生存优势，在慢性氧化应激下积累促癌DNA加合物。研究同时观察到GSTP1敲低后γH2AX灶减少，可能与DNA损伤诱导、修复或感知的改变有关，这种协调衰老与DNA损伤反应的双重能力使GSTP1成为PCa衰老与恶性转化界面的潜在介导因子。研究局限性包括：数据集样本量有限；仅使用雄激素非依赖性细胞系PC3和DU145，缺乏雄激素依赖性LNCaP细胞；衰老表型验证未涵盖Lamin B1及衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）因子；DNA损伤分析仅采用单时间点γH2AX染色。

**结论：** 总体而言，本整合分析鉴定出GSTP1为衰老相关基因。体外实验表明，GSTP1敲低促进增殖、迁移、侵袭并减弱衰老相关标志物。免疫反卷积揭示了GSTP1表达与多种免疫细胞分数的相关性，提示其与肿瘤微环境的潜在关联。这些发现提名GSTP1为有前景的生物标志物和功能研究候选分子，但进一步的机制和治疗学探究仍是必要的。