《Frontiers in Neuroscience》：Identification of microglia-associated hub genes and a CX3CR1/P2RY12 two-gene diagnostic model for cross-subtype epilepsy-associated cortical malformations: integrated transcriptomic analysis with external validation
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局灶性皮质发育不良（FCD）和结节性硬化症（TSC）是耐药性癫痫的主要原因，然而跨这些结构上不同的畸形共享的分子机制仍特征不足。研究人员对来自 GSE256068 的 RNA 测序（RNA-seq）数据进行了整合转录组分析［85 个样本：64 个皮质（FCD2
局灶性皮质发育不良（FCD）和结节性硬化症（TSC）是耐药性癫痫的主要原因，然而跨这些结构上不同的畸形共享的分子机制仍特征不足。研究人员对来自 GSE256068 的 RNA 测序（RNA-seq）数据进行了整合转录组分析［85 个样本：64 个皮质（FCD2a、FCD2b、TSC、对照）和 21 个海马（TLE-HS、对照）］。使用 limma 的差异表达分析分别鉴定出 FCD2a、FCD2b、TSC 和 TLE-HS 与对照相比的 865、1,915、2,772 和 3,749 个差异表达基因（DEGs），并在所有四种亚型中有 49 个共享 DEGs。加权基因共表达网络分析（WGCNA）将棕色和红色模块鉴定为关键疾病相关模块。通过将 WGCNA 枢纽基因（|GS| > 0.5，|MM| > 0.8）与共享 DEGs 相交，研究人员鉴定出 15 个枢纽基因，均与微胶质细胞/髓系谱系（microglia/myeloid lineage）功能相关，包括 IRF8、TLR7、CX3CR1、P2RY12、C3AR1 和 CCR1。基因集富集分析（GSEA）揭示 15 条京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路在所有亚型中一致富集，汇聚于 Toll 样受体、核因子 kB（NF-kB）、趋化因子和补体信号。使用 MCP-counter 和 xCell 的免疫解卷积证实疾病皮质中单核细胞谱系和 T 细胞浸润升高，单核细胞评分与癫痫发作频率呈正趋势。由 LASSO 和随机森林选择的两基因 logistic 回归模型（CX3CR1 + P2RY12）在训练中达到曲线下面积（AUC）0.979，嵌套五折交叉验证 AUC 0.862（95% 置信区间（CI）：0.693–1.000），在 GSE213488 中外部验证 AUC 0.865（95% CI：0.681–1.000）。通过 Enrichr 的药物重定位鉴定 vorinostat（组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂）为顶级候选，并预测 IRF8 为主转录调节因子。体外，用 MHY1485 激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）可保留 BV-2 微胶质细胞中 P2ry12 表达，而脂多糖（LPS）刺激诱导其丢失，支持由 mTOR 过度活跃驱动的独特微胶质细胞/髓系相关程序。这些发现表明，跨亚型转录组汇聚于微胶质细胞先天免疫激活代表 FCD 和 TSC 中的统一分子机制，并且 CX3CR1 和 P2RY12 共同构成一个两基因诊断分类器，其性能令人鼓舞但初步，具有潜在临床效用。
癫痫影响全球约 5000 万人，约 30% 患者尽管接受最佳药物治疗仍对抗癫痫发作药物耐药。FCD 和 TSC 是癫痫手术系列中最常见的结构性病因。FCD 组织病理学分为 I、IIa、IIb 和 III 型，特征为皮质分层异常、异形神经元和气球细胞；TSC 由 TSC1 或 TSC2 功能丧失突变引起，产生与 FCD IIb 型组织学特征重叠的皮质结节。尽管遗传病因不同，临床和组织病理学重叠提示共享下游分子机制。神经炎症，尤其是小胶质细胞激活，日益被认为是癫痫发病机制的贡献因素；FCD 和 TSC 患者手术标本中已证实存在活化小胶质细胞，TSPO-PET 成像显示致癫痫灶中小胶质细胞激活，促炎细胞因子包括 IL-1β、TNF-α 和 IL-6 在癫痫患者脑脊液和脑组织中升高。然而，跨不同癫痫亚型驱动小胶质细胞激活的转录组范围分子程序仍未被完全表征。系统生物学方法，包括 WGCNA 和基于机器学习的特征选择，可用于从高维转录组数据中识别疾病相关基因模块和诊断生物标志物；GSEA 通过考虑全基因排序提供补充信息；MCP-counter 和 xCell 等免疫细胞解卷积方法可表征组织免疫微环境。研究人员主要聚焦 FCD 和 TSC 作为最常见皮质畸形，同时纳入 TLE-HS 作为比较性致癫痫病变，以识别更广泛共享分子特征；具体目标包括：鉴定四种亚型共享 DEGs；构建 WGCNA 共表达网络并识别跨亚型枢纽基因；使用 LASSO 和随机森林构建并外部验证多基因诊断分类器；使用多方法解卷积表征免疫微环境改变；进行 GSEA、药物重定位和转录因子预测；并进行体外验证实验以确认关键枢纽基因在疾病相关刺激条件下的蛋白水平表达模式。研究人员得出，FCD 和 TSC 共享保守的小胶质细胞/髓系相关先天免疫转录组程序，15 个枢纽基因代表跨亚型疾病模块，CX3CR1 + P2RY12 构成两基因诊断分类器，性能令人鼓舞但初步；GSEA 揭示汇聚的 Toll 样受体、NF-kB、趋化因子和补体通路富集，IRF8 为预测的主转录调节因子，vorinostat 为候选治疗药物，支持以小胶质细胞为靶点的策略作为耐药性癫痫跨亚型治疗方法。
关键技术方法（不超过 250 字）：训练队列 GSE256068 来自 Gene Expression Omnibus（GEO），共 85 例：64 个皮质样本（FCD2a n = 18；FCD2b n = 18；TSC n = 14；ControlCortex n = 14）和 21 个海马样本（TLE-HS n = 8；ControlHippocampus n = 13）；外部验证 GSE213488 为皮质灰质样本（FCD2a n = 7；FCD2b n = 6；Control n = 4）。主要方法包括 limma 差异表达分析、WGCNA、GO/KEGG 过代表分析与 GSEA、STRING 蛋白-蛋白相互作用网络、MCP-counter 和 xCell 免疫解卷积、LASSO 与随机森林特征选择、logistic 回归、嵌套五折交叉验证和外部验证、Enrichr 药物重定位与转录因子预测，以及 BV-2 小鼠小胶质细胞 qPCR 与 Western blot 体外验证。
研究结果：3.1 四种癫痫亚型中共有 49 个共享 DEGs。通过 limma 差异表达分析，研究人员鉴定出 FCD2a 与对照 865 个 DEGs、FCD2b 与对照 1,915 个 DEGs、TSC 与对照 2,772 个 DEGs、TLE-HS 与对照 3,749 个 DEGs，其中大多数上调；四向交集分析发现所有亚型共享 49 个 DEGs，均持续上调，提示保守激活特征；三皮质组敏感性分析鉴定出 564 个共享 DEGs，所有 49 个四向共享 DEGs、15 个枢纽基因和 15 条 KEGG 通路均保留。3.2 WGCNA 揭示疾病相关免疫模块。对皮质样本进行 WGCNA，鉴定出棕色模块（MEbrown）和红色模块（MEred）与疾病状态最显著相关；棕色模块基因的 Gene Ontology 富集主要涉及免疫系统过程、炎症反应和髓系白细胞激活。3.3 15 个枢纽基因汇聚于小胶质细胞身份。通过 GS、MM 与共享 DEGs 重叠筛选，研究人员鉴定出 15 个枢纽基因，均与小胶质细胞/髓系谱系功能相关：IRF8、CLEC7A、CYBB、TLR7、CX3CR1、CCR1、C3AR1、P2RY12、IRF5、CD300C、GPR34、MPEG1、RGS18、LILRA2 和 CD84；其中 CX3CR1 和 P2RY12 是经典稳态小胶质细胞标志物，IRF8 是小胶质细胞发育主转录因子，TLR7 为内体先天免疫传感器，C3AR1 介导补体 C3a 信号，IRF5 和 CYBB 驱动炎症效应功能。3.4 GSEA 揭示汇聚的先天免疫通路富集。GSEA 发现 15 条 KEGG 通路在四个比较中均显著富集，聚为六类主题：先天免疫感知（Toll 样受体、NOD 样受体、C 型凝集素受体信号）、炎症信号转导（NF-kB、JAK-STAT、TNF 信号）、免疫细胞通讯（细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号）、吞噬作用（吞噬体、Fc-gamma-R 介导的吞噬作用）、补体与凝血级联、造血/免疫细胞生物学（造血细胞谱系、破骨细胞分化、T
H17 分化）；TLR7 参与 TLR 信号，IRF5/IRF8 参与 NF-kB 信号，CCR1/CX3CR1 参与趋化因子信号。3.5 髓系和 T 细胞浸润与临床特征相关。MCP-counter 分析显示 FCD2a、FCD2b 和 TSC 中单核细胞谱系和 T 细胞评分较 ControlCortex 显著升高，xCell 独立确认单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞扩增；探索性分析显示 FCD2a 中单核细胞谱系评分与癫痫发作频率呈非显著正趋势（Spearman rho = 0.478，P = 0.052），T 细胞评分与患者年龄显著负相关（Spearman rho = ?0.373，P = 1.34e-3）。3.6 PPI 网络和虚拟敲除分析。STRING 分析显示以 IRF8-TLR7-CX3CR1 轴为中心的密集 PPI 网络；in silico 节点删除分析识别出 CLEC7A、LILRA2 和 IRF5，随后是 C3AR1 和 CD84，其去除导致棕色模块连接性最大下降。3.7 CX3CR1 + P2RY12 双基因诊断模型。LASSO 选择五个基因（CX3CR1、C3AR1、P2RY12、IRF5、RGS18），随机森林将 CX3CR1、P2RY12、GPR34、CD84 和 CD300C 列为前五特征，算法交集得到 CX3CR1 和 P2RY12；两基因 logistic 回归模型训练集 AUC 为 0.979（95% CI：0.947–1.000），嵌套五折交叉验证 AUC 为 0.862（95% CI：0.693–1.000），准确率 94.12%，敏感性 97.18%，特异性 78.57%，CX3CR1 在五折中均被选中，P2RY12 在五折中四折被选中；外部验证 GSE213488 AUC 为 0.865（95% CI：0.681–1.000）。3.8 药物重定位和转录因子预测。Enrichr 分析鉴定 vorinostat（SAHA）为假设生成性候选药物，其为 FDA 批准且可透过血脑屏障的 HDAC 抑制剂（校正 P = 0.042），其他候选包括 piperlongumine、emetine、tamibarotene 和 ciclopirox；IRF8 被预测为顶级上游转录因子（校正 P = 1.45E-7）。3.9 LPS 刺激和 mTOR 激活 BV-2 小胶质细胞的体外验证。qPCR 显示 LPS 刺激显著上调 Irf8 和 Tlr7 mRNA，P2ry12 mRNA 在 LPS 组显著下调，而在 MHY1485 组维持或轻度上调；Cx3cr1 在 LPS 刺激下降，在 MHY1485 处理上升；Western blot 证实 Irf8 蛋白在 LPS 和 MHY1485 组均显著上调，P2ry12 蛋白在 LPS 组降低而在 MHY1485 处理细胞中维持，磷酸化 S6（p-S6，Ser240/244）在 MHY1485 组强烈升高，证实 mTORC1 成功激活，而 LPS 组未变。
讨论部分总结：研究人员认为，CX3CR1 和 P2RY12 虽为经典稳态小胶质细胞标志物，但在某些活化人小胶质细胞状态中仍可高表达，患者组织中的显著上调可能反映小胶质细胞群体扩张而非单纯每细胞下调；体外实验支持该解释，即 mTOR 驱动激活时 P2ry12 表达保留或上调，而经典 TLR4 介导炎症时显著降低。P2RY12 通过嘌呤能信号调节小胶质细胞激活状态，FCD 和 TSC 中 mTOR 通路过度激活可能驱动一种保留稳态身份特征的独特小胶质细胞/髓系相关程序。IRF8-IRF5-TLR7 轴构成有吸引力的调控级联，C3AR1 和补体通路富集提示补体介导的突触修剪参与癫痫网络重组。局限性包括：回顾性设计且使用公共数据集；外部验证样本量有限；训练与验证数据集间缺乏批效应校正；bulk RNA-seq 无法解析小胶质细胞丰度、激活状态或浸润髓系细胞；海马 TLE-HS 与皮质 FCD/TSC 样本的跨区域差异可能贡献于观察到的特征，尽管三皮质组敏感性分析确认稳健性；BV-2 小鼠小胶质细胞系体外验证提供了蛋白水平确认，但仍需人 iPSC 来源小胶质细胞或原代人类手术标本进一步验证；药物预测仍纯属计算，需实验确认。未来方向包括 scRNA-seq 验证、手术标本 IHC 确认和条件敲除模型功能研究。
研究结论翻译：局灶性皮质发育不良和 TSC 共享保守的小胶质细胞/髓系相关先天免疫转录组程序。15 个枢纽基因代表跨亚型疾病模块，CX3CR1 + P2RY12 提供两基因诊断分类器，性能令人鼓舞但初步（训练 AUC 0.979；嵌套 CV AUC 0.862；外部验证 AUC 0.865）。GSEA 揭示汇聚的 TLR、NF-kB、趋化因子和补体通路富集。IRF8 是预测的主转录调节因子，vorinostat 是候选治疗药物。这些发现支持以小胶质细胞为靶点的策略作为耐药性癫痫的跨亚型治疗方法。
