Dibucaine诱导自噬流并降低SNCA重复患者iPSC来源多巴胺能神经元中Ser129磷酸化α-synuclein

《Frontiers in Neurology》：Dibucaine induces autophagic flux and reduces Ser129-phosphorylated α-synuclein in induced pluripotent stem cell–derived neurons with SNCA duplication

　　

α-synuclein（α-syn）以Lewy小体（Lewy bodies）和Lewy神经突（Lewy neurites）形式的积累是帕金森病（PD）的神经病理学标志，并与疾病进展密切相关。因此，靶向自噬（autophagy）通路以增强α-syn聚集体的清除代表了一种有前景的治疗策略。在本研究中，研究人员使用大鼠胚胎原代神经元进行了高通量筛选，随后在人类诱导多能干细胞（iPSC）来源神经元中验证了所鉴定化合物。研究人员鉴定出Dibucaine（一种局部麻醉药）为可在神经元模型中诱导自噬流（autophagic flux）的化合物。在携带SNCA重复的PD患者来源的人iPSC衍生多巴胺能神经元中，Dibucaine降低了Ser¹²⁹磷酸化α-synuclein（pS¹²⁹ α-syn）的细胞水平。在SH-SY5Y细胞中，Dibucaine增加了5’-AMP活化蛋白激酶（AMPK）Thr¹⁷²磷酸化。LY364947通过一种尚未明确的机制部分减弱了Dibucaine诱导的iPSC来源神经元中LC3-II积累。尽管AMPK的需求以及pS¹²⁹ α-syn降低的潜在机制仍未解决，但研究人员的发现表明，Dibucaine在疾病相关的人神经元中诱导自噬流并降低pS¹²⁹ α-syn水平。

帕金森病（PD）是最常见的神经退行性运动障碍，病理特征为黑质多巴胺能神经元中α-synuclein（α-syn）聚集物即Lewy小体（Lewy bodies）的积累。病理性α-syn以朊病毒样方式传播，驱动疾病发生和进展。当前多巴胺能治疗仅缓解症状且常伴严重副作用，疾病修饰疗法存在迫切未满足需求。α-syn可由泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬-溶酶体途径（ALP）降解，但UPS仅处理小、可溶性寡聚体；自噬活性随年龄下降且在PD患者中明显受损，故ALP在病理条件下更关键。分子伴侣介导的自噬（CMA）和巨自噬主要负责α-syn清除，但致病SNCA突变（如A53T、A30P）和翻译后修饰α-syn异常与LAMP2A相互作用并损害溶酶体摄取，从而破坏CMA。因此，药理干预靶向巨自噬成为PD有前景的治疗策略。自噬由mTOR依赖和mTOR非依赖通路调控；mTORC1通过磷酸化ULK1等负调控自噬，AMPK可通过直接调控ULK1和间接调节mTORC1信号促进自噬。研究人员因此开展化合物筛选，并在人iPSC来源神经元中验证。

关键技术方法（≤250字）：研究人员使用大鼠胚胎原代皮层神经元（Crlj:WI Wistar，E18/E19）建立384孔高通量表型筛选，采用AAVdj-hSynI-EGFP-LC3B-mCherry自噬流探针，筛选1,637个生物活性化合物（FDA批准库、自噬相关库、激酶抑制剂库和脑渗透性化合物集），以GFP/mCherry比值及核计数为指标；随后在人类诱导多能干细胞（iPSC）来源神经元中验证。人SNCA重复iPSC系DupA13来自既往研究建立的家族性PD患者（PARK4），经Juntendo University School of Medicine伦理委员会批准并有供者书面知情同意；本研究未招募新参与者或采集新样本。还使用SH-SY5Y细胞。通过western blot检测LC3-II（微管相关蛋白1轻链3-II，自噬体膜标志物）、pS¹²⁹ α-syn及AMPK/mTOR/ULK1/p70S6K/S6等信号。

研究结果：
1 High-throughput screening for autophagy inducers in neuronal cells（神经元细胞中自噬诱导剂的高通量筛选）：研究人员在鼠原代皮层神经元中以EGFP-LC3B-mCherry探针筛选四个化合物库共1,637个化合物。Z′因子为0.04–0.69。初筛162个命中，复筛后6个可重复命中：dibucaine、memantine、haloperidol、bromocriptine、RG-7090和MaxiPost。10 μM时均激活自噬，1 μM时除memantine外均激活。bromocriptine、haloperidol、RG-7090和MaxiPost伴核计数降低，dibucaine和memantine在24 h筛选条件下未明显降低核计数。

2 Secondary evaluation of candidate compounds using endogenous LC3-II（使用内源性LC3-II对候选化合物进行二次评价）：通过western blot检测内源性LC3-II。10 μM dibucaine在六种化合物中效果最高，LC3-II/GAPDH较DMSO增加约3–4倍；haloperidol也显著增加但伴核计数降低；其余四种弱于Torin-1。加入E64d和Pepstatin A后，dibucaine仅引起轻度LC3-II积累，提示其自噬机制不同于其他化合物，但不能排除系统饱和。综合支持dibucaine增加原代神经元自噬流；仅两次独立实验，相对幅度视为探索性。

3 Dibucaine induces autophagic flux and reduces pS¹²⁹ α-synuclein levels in iPSC-derived dopaminergic neurons（Dibucaine在iPSC来源多巴胺能神经元中诱导自噬流并降低pS¹²⁹ α-synuclein水平）：DupA13 iPSC分化为多巴胺能神经元，酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元占87%±2%。Dibucaine或Torin-1均增加LC3-II，E64d+Pepstatin A进一步增加，支持二者增强自噬流。5天处理后，30 μM dibucaine降低pS¹²⁹ α-syn；Torin-1也降低pS¹²⁹ α-syn，但伴TH和GAPDH降低，标准化后并非真实效果。Torin-1降低每孔总蛋白产量，而dibucaine至30 μM未降低总蛋白产量。结果提示dibucaine诱导自噬流并降低pS¹²⁹ α-syn信号，但不能区分自噬降解pS¹²⁹ α-syn与降低Ser¹²⁹磷酸化。

4 Effects of dibucaine-related local anesthetics on autophagy-associated readouts in SH-SY5Y cells（Dibucaine相关局部麻醉药对SH-SY5Y细胞自噬相关读数的影响）：在SH-SY5Y中，30 μM dibucaine处理4 h未明显降低总蛋白产量。与proparacaine、lidocaine和tetracaine相比，这些局麻药LC3-II增加均小于dibucaine，提示dibucaine对LC3-II积累的作用可能并非仅由钠通道阻断所致。

5 Dibucaine induces autophagy without broad suppression of canonical mTORC1 signaling（Dibucaine诱导自噬而未广泛抑制经典mTORC1信号）：Torin-1显著降低mTOR、p70S6K、S6和ULK1 Ser⁷⁵⁷磷酸化。Dibucaine未明显降低mTOR Ser²⁴⁴⁸或p70S6K磷酸化，部分降低S6 Ser^235/236和ULK1 Ser⁷⁵⁷磷酸化。因这些磷酸化事件也可受非mTOR激酶、磷酸酶和信号串扰影响，部分变化不一定表示广泛mTORC1抑制；不能排除部分减弱mTORC1信号的贡献。

6 Dibucaine increases AMPK Thr¹⁷² phosphorylation during autophagy induction（Dibucaine在自噬诱导期间增加AMPK Thr¹⁷²磷酸化）：筛选蛋白激酶抑制剂发现，LY364947、JAK3 inhibitor VI、AG1478、sorafenib和Compound C与较小的dibucaine诱导LC3-II反应相关。LY364947和Compound C不抑制Torin-1相关LC3-II反应，而JAK3 inhibitor VI、AG1478和sorafenib降低dibucaine和Torin-1两者反应。Compound C虽常用作AMPK抑制剂但影响多个激酶；dibucaine增加SH-SY5Y细胞AMPK α亚基Thr¹⁷²磷酸化，Compound C降低该增加，但不能据此证明AMPK依赖性。LY364947对dibucaine诱导的AMPK Thr¹⁷²磷酸化影响很小。SB431542不抑制dibucaine诱导自噬；ALK5敲低后dibucaine仍诱导自噬，提示LY364947通过ALK5非依赖机制。VEGFR、RIPK2和CK1δ被排除或沉默后未抑制，LY364947敏感靶点仍未鉴定。

7 Effects of LY364947 on dibucaine-associated LC3-II and pS¹²⁹ α-synuclein responses in PARK4 iPSC-derived dopaminergic neurons（LY364947对PARK4 iPSC来源多巴胺能神经元中dibucaine相关LC3-II和pS¹²⁹ α-synuclein反应的影响）：在DupA13神经元中，dibucaine增加LC3-II；LY364947部分减弱该增加，SB431542无类似作用。LY364947也减弱30 μM dibucaine处理5天引起的pS¹²⁹ α-syn降低。然而，这些结果仅表明一个未鉴定的LY364947敏感细胞过程、LC3-II反应和pS¹²⁹ α-syn变化之间的药理学关联，未证明LY364947特异性抑制自噬流，也未证明pS¹²⁹ α-syn降低由自噬降解介导。

讨论部分总结：自噬-溶酶体途径受损是PD核心病理特征。既往研究探索mTOR抑制剂（如rapamycin）、mTOR非依赖自噬增强剂（如trehalose）及老药（如metformin、nilotinib）等，但存在血脑屏障通透性、效力或脱靶毒性等转化障碍。本研究建立鼠原代神经元高通量筛选平台，其优点是保留脑内在体生理特征、神经元功能和突触网络，但板间Z′变异较大，初筛命中复筛率低，需标准化和严格质控。随后研究人员在人iPSC来源神经元和患者来源神经元中验证，发现dibucaine在鼠原代神经元、人iPSC来源神经元及PARK4患者来源多巴胺能神经元中诱导自噬流。Dibucaine为酰胺类局麻药，可逆阻断电压门控钠通道；高浓度500 μM时也用作钙蛋白酶激活剂。其LC3-II反应大于其他局麻药，提示可能不是局麻药类效应，也不仅由钠通道阻断所致，可能与其亲脂性喹啉核心和取代侧链有关，但构效关系未建立。mTORC1有自噬非依赖功能，靶向可能带来免疫抑制和伤口愈合受损等不良反应，因此mTOR非依赖自噬诱导剂受关注。本研究表明dibucaine以mTOR非依赖方式诱导自噬，但不能排除部分减弱mTORC1信号的贡献。Dibucaine还降低PARK4患者iPSC来源多巴胺能神经元中pS¹²⁹ α-syn，但自噬流诱导与pS¹²⁹ α-syn降低的因果关系未证明。当前iPSC来源神经元中成熟不溶性α-syn聚集通常需长期成熟，本培养条件下未容易观察到强不溶聚集体，因此本研究评估pS¹²⁹ α-syn细胞水平，未直接评估成熟α-syn聚集物清除。Dibucaine诱导自噬流并增加SH-SY5Y细胞AMPK Thr¹⁷²磷酸化；AMPK激活在PD治疗中受关注，但AMPK激活与dibucaine诱导自噬流的关系仍为关联。未确定上游激酶，AMPK功能需求未建立。AMPK并非Torin-1诱导自噬所需；与Torin-1比较未证明dibucaine通过AMPK促进pS¹²⁹ α-syn周转。LY364947作用可能位于AMPK下游，独立或分叉于Torin-1靶向通路；ALK5、RIPK2、CK1δ沉默均未抑制，精确靶点需无偏方法如光亲和化学蛋白质组学、热蛋白质组分析（TPP）或全基因组CRISPR筛选。Dibucaine因局麻毒性不直接作为PD治疗候选，需药物化学优化分离自噬调节作用与局麻活性/毒性。局限包括：完全依赖体外细胞模型，尚无PD动物模型体内验证；长期dibucaine对神经元存活和完整性未全面评估；血脑屏障通透性、代谢稳定性、全身毒性等药代动力学未评估。需进一步体内研究及全面药代动力学分析。

研究结论：尽管AMPK的需求和pS¹²⁹ α-syn降低的机制尚未解决，研究人员的发现表明Dibucaine在疾病相关人神经元中诱导自噬流并降低pS¹²⁹ α-syn水平。