铁衰老相关基因在牙周炎中的诊断价值：基于生物信息学分析与实验验证的IRF1、SLC1A5、PDE4B和IL1B生物标志物研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：The role of ferro-aging genes in periodontitis: novel insights based on bioinformatics analysis

　　

背景：牙周炎（periodontitis, PD）患者龈沟液和局部牙周组织中的铁离子浓度显著升高，呈现以铁过载为主要特征的铁代谢紊乱。过量游离铁可通过芬顿反应（Fenton reaction）持续催化活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成，为脂质过氧化提供持续化学驱动力，从而构成铁衰老（ferro-aging）启动的关键生化基础。然而，铁衰老在PD发病机制中的具体作用及其分子调控网络仍不清楚。方法：研究人员从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）获取PD相关转录组数据集。通过将铁衰老相关基因集（ferro-aging-related gene set, FAG）与差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）取交集，筛选PD中的铁衰老相关差异表达基因（ferro-aging-related differentially expressed genes, FAGDEGs）。随后，综合应用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）和两种机器学习算法——随机森林（Random Forest, RF）和最小绝对收缩和选择算子（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator, LASSO）回归——进一步筛选关键铁死亡相关基因（key ferroptosis-associated genes, KFAGs）。采用受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线评估KFAGs的诊断性能，并使用实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR）进行实验验证。此外，进行免疫细胞浸润分析，以探索KFAGs表达水平与免疫细胞类型之间的潜在关联。结果：该研究共鉴定出1379个DEGs，与FAG取交集后获得11个FAGDEGs。经WGCNA和机器学习算法筛选，最终鉴定出4个KFAGs：IRF1、SLC1A5、PDE4B和IL1B。ROC曲线分析结果显示，上述4个基因的曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）均大于0.6，表明其在PD诊断中具有良好的潜在价值。RT-qPCR实验结果表明，这4个KFAGs在PD中的表达趋势与数据库分析结果一致。免疫细胞浸润分析进一步揭示，KFAGs表达水平与多种免疫细胞亚群的丰度或活化状态显著相关。结论：该研究结果表明，IRF1、SLC1A5、PDE4B和IL1B是与PD中铁衰老过程相关的关键生物标志物。这一发现为进一步阐明铁代谢紊乱和铁衰老在PD发病机制中的协同作用提供了新的分子证据和研究方向。

研究背景：牙周炎（periodontitis, PD）是成人失牙的主要原因，以牙龈、牙周膜、牙骨质和牙槽骨等牙周支持组织进行性破坏为特征。近年来，细胞衰老在PD发病机制中的作用受到关注，衰老细胞在牙周组织中积累，并通过衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）加重局部炎症和组织破坏。PD病理进展并非单一机制驱动，铁稳态失调与细胞衰老之间的复杂互作构成关键病理轴。临床和动物研究观察到PD存在铁代谢紊乱倾向。铁稳态失衡不仅影响全身，还可通过多种机制加重局部牙周微环境中的组织破坏。在PD微环境中，铁过载直接损害免疫细胞功能，加速其细胞衰老，削弱宿主防御并加重慢性炎症。铁死亡（ferroptosis）作为一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的新型细胞死亡形式，已在多种衰老相关疾病中被发现异常激活。在PD微环境中，持续炎症和氧化应激可能同时诱导牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞发生衰老与铁死亡，形成恶性循环，共同驱动疾病进展。铁衰老（ferro-aging）是整合铁死亡与衰老核心特征的新兴交叉生物学概念。两者虽共享铁依赖和脂质过氧化通路，但在时间尺度、生物学结局和干预策略上存在本质差异。铁衰老是由铁过载触发的慢性、进行性衰老程序，由长链脂酰辅酶A合成酶家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL4）驱动，并由脂质过氧化介导，特征为亚致死、持续性铁积累和氧化应激。铁死亡则是急性、受调控的细胞死亡形式。现有研究几乎完全聚焦铁死亡的急性致死事件，缺乏可区分铁衰老与铁死亡的特异性分子指标，难以从公共转录组数据中有效识别PD中铁衰老驱动的患者亚型，也难以量化铁衰老相关基因与PD进展或全身衰老的关联。因此，研究人员旨在通过生物信息学挖掘结合实验验证，筛选并验证PD中铁衰老特征性生物标志物，以区分铁衰老与经典铁死亡事件，并为揭示PD患者慢性功能衰退的独立驱动机制提供新的生物标志物系统。
关键技术方法概述：研究人员从GEO获取PD相关数据集GSE16134和GSE23586，二者均为GPL570芯片平台、牙龈组织来源，作为测试集；GSE16134含241例PD和69例健康对照，GSE23586含3例PD和3例健康对照；GSE10334含183例PD和64例健康对照，作为验证集。FAG包含95个基因。研究采用DEGs分析、WGCNA、LASSO和RF筛选KFAGs，构建列线图诊断模型，并用ROC、校准曲线和决策曲线分析（decision curve analysis, DCA）评估；采用单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）分析22种免疫细胞浸润；采用RT-qPCR检测6例临床牙龈组织（3例PD、3例健康对照，来自暨南大学附属第一医院伦理批准）验证。
研究结果：
3.1 数据集预处理与合并：通过R软件“sva”包对GSE16134和GSE23586进行整合、标准化和批次效应去除，主成分分析（principal component analysis, PCA）显示合并后样本批次效应显著降低。
3.2 差异基因表达分析：使用“limma”包在合并PD数据集中鉴定出1379个DEGs，其中815个上调、564个下调，并以火山图和热图展示表达水平与分布。
3.3 铁衰老相关差异表达基因鉴定与功能富集分析：将95个FAG与1379个DEGs取交集，得到11个FAGDEGs，即RUNX3、IL1B、SLC1A5、IGFBP7、IRF1、PDE4B、CTSB、TXNIP、EGR1、IL6和PTGS2。基因本体（Gene Ontology, GO）分析显示，生物学过程主要富集于细胞对生物刺激的反应、T细胞分化和淋巴细胞分化；细胞组分主要涉及内质网腔、黑素体和色素颗粒；分子功能主要涉及生长因子受体结合和细胞因子活性。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析显示，FAGDEGs主要参与C型凝集素受体信号通路、TNF信号通路、NOD样受体信号通路、百日咳和IL-17信号通路。
3.4 WGCNA模块检测与分析结果：WGCNA纳入4033个基因，选择软阈值β=8（R²=0.9），最终得到8个模块。红色模块（r=0.67，p<0.001）和蓝色模块（r=-0.41，p<0.001）与PD相关性较强，被选作进一步分析。
3.5 铁衰老关键基因筛选：将红、蓝模块核心基因与DEGs取交集，得到1078个与PD相关的模块差异基因；再与FAG取交集，鉴定出7个PD铁衰老相关关键基因：IRF1、SLC1A5、PTGS2、TXNIP、PDE4B、IL1B和IL6。
3.6 机器学习进一步鉴定铁衰老关键核心基因：以全部样本表达谱为输入、PD状态为二分类结局，LASSO在lambda.1se标准下筛选出4个基因，RF按MeanDecreaseGini保留7个基因；两种方法交集得到4个关键铁衰老相关基因（key ferro-aging-related genes, KFAGs）：IRF1、SLC1A5、PDE4B和IL1B。
3.7 PD诊断模型构建与验证：基于4个KFAGs构建多基因预测模型和列线图，模型AUC为0.897，校准曲线支持其预测可靠性，DCA提示基于该模型的决策可能为PD患者带来额外获益。4个KFAGs的ROC分析AUC均大于0.6，且在PD中表达显著高于健康组织（P<0.05）；GSE10334验证数据集也支持上述结果。
3.8 免疫细胞浸润分析：ssGSEA量化22种免疫细胞亚型。PD组中1型辅助性T细胞（Type 1 T helper, Th1）细胞、活化B细胞、活化CD4⁺ T细胞、活化树突状细胞、自然杀伤细胞、17型辅助性T细胞（Type 17 T helper, Th17）等显著升高。IRF1和SLC1A5与某些免疫细胞如2型辅助性T细胞（Type 2 T helper, Th2）呈负相关，KFAGs与多种免疫细胞存在强关联。
3.9 RT-qPCR验证关键核心基因：对6例临床牙龈组织样本（3例PD、3例健康对照）进行RT-qPCR，结果显示IRF1、SLC1A5、PDE4B和IL1B在PD组中的表达均显著高于对照组，且趋势与生物信息学分析一致。
讨论总结：PD是典型的慢性炎性疾病，其病理特征包括ROS升高、线粒体功能障碍、脂质过氧化和促炎因子释放。在PD中，牙龈出血释放的红细胞分解释放大量游离铁，铁离子催化高活性自由基产生，触发强烈氧化应激并直接损伤牙周组织。基于此微环境，牙周膜成纤维细胞、成骨细胞等可能发生铁死亡或进入衰老状态，随后分泌大量SASP因子，持续招募炎症细胞、降解胶原并抑制成骨，导致不可逆骨丢失。铁死亡作为急性细胞死亡事件，更适合解释局灶性和快速组织坏死，但难以完全解释PD缓慢、弥漫和持续数十年的组织破坏特征。铁衰老作为铁依赖性慢性衰老机制，以长期铁积累和脂质过氧化诱导的细胞功能进行性下降、组织再生受损和全身衰老为特征，与PD数十年缓慢加重的牙槽骨吸收和软组织破坏在时间特征上吻合，因此PD可能是研究铁衰老机制及临床干预的理想模型。研究人员整合GSE16134和GSE23586，初步识别11个FAGDEGs；GO和KEGG分析显示这些基因参与生物刺激应答、T细胞分化、生长因子受体结合、细胞因子活性以及C型凝集素受体、TNF、NOD样受体和IL-17等信号通路。随后通过WGCNA和机器学习鉴定出4个KFAGs：IRF1、SLC1A5、PDE4B和IL1B。ROC分析提示四者对PD具有较高诊断价值，且在PD中显著上调，GSE10334也验证了这些发现。免疫浸润分析显示，这四个KFAGs与树突状细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等免疫细胞呈强正相关；IRF1和SLC1A5与Th1应答正相关，与Th2应答负相关。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis）可激活Th1细胞，使其分泌大量IFN-γ和TNF-α，一方面激活巨噬细胞并促进破骨细胞分化，导致牙槽骨吸收，另一方面通过IFN-γ介导的信号通路抑制Th2功能，形成Th1/Th2失衡的免疫微环境。因此，PD局部呈现典型Th1优势免疫应答特征，这些KFAGs在PD免疫过程中发挥重要作用。IRF1是干扰素调节因子1（interferon regulatory factor 1, IRF1），属于干扰素调节因子家族，是调节免疫应答和炎症反应的关键转录因子，主要通过JAK/STAT信号通路激活，参与I型干扰素（IFN-α/β）和II型干扰素（IFN-γ）介导的免疫应答。本研究发现PD病变组织中IRF1表达显著升高，并与Th1细胞活化正相关，这与PD背景下IRF1表达上调的报道一致。但部分体外研究结论看似矛盾：De Andrade K Q和Jauregui C E等报道P. gingivalis可抑制牙龈上皮细胞或成纤维细胞中的IRF1表达。作为牙周组织屏障细胞，牙龈上皮细胞和成纤维细胞暴露于活菌时，可能因细菌分泌蛋白酶导致STAT1/IRF1蛋白直接降解或转录抑制，从而有利于局部免疫逃逸。Elkaim R等发现，活菌显著降低IRF1 mRNA和蛋白水平，而纯化的P. gingivalis脂多糖（LPS-Pg）处理则显著增加IRF1表达，提示IRF1表达调控可能依赖细菌存在形式及其与宿主细胞的互作方式。其他炎症疾病研究显示，当细菌成分尤其是LPS占主导时，可诱导抗原提呈细胞产生IL-12，促进初始CD4⁺ T细胞向Th1细胞分化；同时IL-12和IFN-γ协同激活STAT1，上调IRF1。IRF1作为转录因子还可促进Th1型趋化因子和IFN-γ产生，放大Th1型炎症应答。虽然该机制仍需在PD中直接验证，但结合本研究中IRF1表达与Th1应答正相关，研究人员推测在PD复杂病变组织中，微生物相关分子模式如LPS可能驱动浸润免疫细胞高表达IRF1，从而促进局部Th1型炎症放大。SLC1A5又称ASCT2，编码钠依赖性中性氨基酸转运体，是哺乳动物细胞摄取谷氨酰胺的主要通道。在细胞氧化还原稳态调控中，SLC1A5介导的谷氨酰胺摄取是谷胱甘肽（glutathione, GSH）生物合成的限速步骤。GSH是谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）清除脂质过氧化物所必需的辅因子，因此SLC1A5功能状态可能间接决定细胞对铁依赖性氧化损伤的敏感性，参与铁死亡或铁衰老。本研究进一步证实炎症牙周组织中SLC1A5转录水平显著上调，这种异常表达可能通过铁死亡调控、免疫代谢重编程和骨免疫耦合参与PD发病。SLC1A5表达与免疫细胞浸润程度密切相关，尤其涉及髓系和淋巴系细胞。鉴于谷氨酰胺供应对T细胞和巨噬细胞活化、增殖和效应功能必不可少，异常SLC1A5可能通过免疫代谢重编程参与PD进程。PDE4B属于磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4, PDE4）家族，该家族特异性水解cAMP，包括A、B、C、D四种同工酶。PDE4B在免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞中优势表达，并特异性调节炎症信号。现有临床研究常将PDE4作为整体靶点，显示其在PD中显著上调，但尚无PDE4B亚型在PD患者中的独立定量数据。本研究发现PDE4B在PD中显著上调并与多种免疫细胞相关。考虑到PDE4B在免疫细胞中优势表达以及PD本质上是免疫细胞浸润和激活的炎症性疾病，研究人员推断PDE4B可能是牙周组织PDE4表达上调的主要贡献亚型。IL1B方面，牙周病原感染可诱导局部组织形成铁过载与炎症并存的微环境，从而驱动IL1B基因转录上调。IL1B编码白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β），是IL-1家族最重要的分泌型促炎细胞因子，其持续高表达是PD牙周组织破坏的核心驱动因素之一。在PD病理背景下，罗格列酮对ACSL4的抑制活性及其对IL-1β的调控效应值得深入研究。在正畸诱导炎症性牙根吸收模型中，牙周膜细胞接受压应力和IL-1β联合刺激后，ACSL4表达水平和Fe²⁺浓度显著升高，而ACSL4抑制剂罗格列酮可有效逆转这些表型。该研究提示牙周组织水平存在“IL-1β刺激—ACSL4上调—铁过载通路激活”的因果链，罗格列酮作为ACSL4抑制剂可抑制ACSL4表达和铁过载，从而阻断铁衰老过程。同时，多项动物实验显示罗格列酮可显著降低实验性PD牙周组织中IL-1β蛋白表达，促进M2巨噬细胞极化，增加抗炎因子IL-10表达，降低M1/M2巨噬细胞比例。因此，研究人员推断IL-1β和ACSL4可能在PD铁衰老过程中构成上游-下游调控轴，罗格列酮因具有独特双靶点药理特性，可在上游抑制IL-1β产生、下游抑制ACSL4活性，从而较单靶点干预表现出更全面的牙周保护潜力。本研究存在局限：核心基因鉴定和免疫浸润分析主要依赖公共数据库转录组数据，IRF1、SLC1A5、PDE4B和IL1B在牙周铁衰老中的功能角色以及免疫细胞浸润与铁衰老之间的因果联系仍需体外和体内验证；虽纳入独立外部验证数据集GSE10334，但仍属转录组水平的回顾性验证；RT-qPCR验证仅基于6例临床组织样本，样本量有限，可能影响统计功效和泛化性。未来需更大临床队列、动物模型和功能实验以全面阐明这些生物标志物的分子机制及转化潜力。研究结论翻译：在本研究中，研究人员鉴定出IRF1、SLC1A5、PDE4B和IL1B为PD中铁衰老相关的关键生物标志物。