《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Establishment and validation of porcine embryo genomic selection system through SCNT technique
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背景：胚胎基因组选择（embryo genomic selection, EGS）指在植入前阶段进行基因分型和基因组预测的技术。与体外胚胎生产方法结合时，EGS增强选择强度，并具有防止携带遗传缺陷或非期望性别后代出生的潜力。鉴于体细胞核移植（somatic c
背景：胚胎基因组选择（embryo genomic selection, EGS）指在植入前阶段进行基因分型和基因组预测的技术。与体外胚胎生产方法结合时，EGS增强选择强度，并具有防止携带遗传缺陷或非期望性别后代出生的潜力。鉴于体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer, SCNT）技术能够将供体猪的遗传信息复制到早期胚胎中，本研究旨在通过整合SCNT与基因组选择方法建立并验证完整的猪EGS工作流。
结果：首先，研究人员利用来自已知基因型和表型的候选猪的供体细胞构建猪SCNT胚胎。对SCNT胚胎进行的细胞活检显示，从囊胚中收集约9.5个滋养层（trophectoderm, TE）细胞对后续发育影响最小。接着，研究人员优化了用于TE活检细胞的全基因组多重置换扩增（multiple displacement amplification, MDA）方案，以进行80 K单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）阵列分析。SNP检出率范围为94.44%至99.77%，SCNT胚胎与其供体猪之间的基因型一致性大多超过95%。最后，研究人员使用GBLUP和贝叶斯方法计算了三个生产性状的基因组估计育种值（genomic estimated breeding values, GEBVs），并观察到每个胚胎与其供体之间的GEBVs呈强正相关（r > 0.90）。
结论：本研究建立并验证了完整的猪EGS工作流，包括胚胎活检、全基因组扩增、SNP基因分型和GEBV预测。该工作流为在猪育种中应用EGS提供了技术基础，并具有通过早期胚胎选择加速遗传改良的潜力。此外，结果表明SCNT可用于为养猪业复制优良遗传资源。
研究背景：畜牧育种是提高遗传进展和畜禽生产效率的基本途径。早期选择依赖表型观察，随后最佳线性无偏预测（best linear unbiased prediction, BLUP）整合表型与系谱信息，标记辅助选择和Meuwissen于2001年提出的基因组选择（genomic selection, GS）逐步发展。GS利用全基因组高密度单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）标记构建统计模型，将基因型与表型关联，从而预测个体基因组估计育种值（genomic estimated breeding value, GEBV）。已有研究用不同密度SNP芯片对大型奶牛群体基因分型并评估预测准确性，也用于欧洲地方猪种和野猪基因组多样性评估。然而，传统GS依赖出生后采样和基因分型，存在时间滞后，阻碍进一步缩短世代间隔，限制遗传进展效率；难以预先识别染色体异常、潜在遗传风险或低育种值个体，导致低效繁殖成本增加。为此提出胚胎基因组选择（embryo genomic selection, EGS），即在植入前胚胎阶段进行基因组检测和评估，选择染色体倍性正常、目标性状育种值高且无有害突变的胚胎移植，从而降低死产和先天异常，防止低性能非期望性别个体出生。结合超数排卵和体外胚胎生产，EGS可对大量候选胚胎基因分型，扩大候选池，提高选择强度和遗传多样性。EGS概念可追溯到原位杂交鉴定牛胚胎Y染色体，近期在反刍动物中形成整合SNP芯片基因分型与胚胎活检的EGS框架。例如Silvestri et al.利用全基因组SNP分析发现牛胚胎5.0%至14.1%染色体异常，整倍体胚胎妊娠率59.6%，非整倍体5.8%。2025年绵羊EGS成功建立，TE活检结合50 K SNP芯片检测率93.71%，结合全基因组测序和填充可增至约98%，多个性状GEBVs在胚胎与出生羔羊间强一致（r = 0.91–0.98）。但猪尚无EGS建立报道，猪EGS应用受限于缺乏稳定活检策略、可靠全基因组扩增（whole-genome amplification, WGA）方案以及连接胚胎与后代的遗传评估验证。为此，研究人员采用SCNT技术生成与供体猪遗传一致的克隆胚胎，作为测试胚胎采样策略、WGA方法、SNP芯片基因分型和育种值估计的模型。结果显示克隆胚胎来源SNP基因型与供体猪一致率95.76%，三个生产性状GEBVs在胚胎与供体间正相关。研究提供并验证了猪育种完整EGS工作流。
关键技术方法概括：研究人员从Wuhan COFCO Meat Co., Ltd.提供的Duroc和Yorkshire候选公猪（120–130日龄）采集耳组织建立成纤维细胞；从当地屠宰场三元杂交猪[Duroc × (Landrace × Yorkshire), DLY]卵巢获取卵母细胞并体外成熟。以SCNT构建克隆胚胎并移植代孕母猪。对8-cell、16-cell和囊胚阶段进行激光辅助活检；囊胚期采集TE细胞。低输入细胞和TE活检细胞采用MDA进行WGA，用猪80 K功能变异基因分型芯片进行SNP分型。用HiBLUP和HiBayes估计遗传参数和GEBVs，参考群体包括Duroc和Yorkshire。统计采用GraphPad Prism 9.0.0、t检验和单因素方差分析。
研究结果：
1. 细胞活检在猪SCNT胚胎中的应用：研究人员先对8-cell和16-cell SCNT胚胎进行卵裂球活检，发现囊胚形成率显著降低（8-cell活检4.46%±3.89%，对照34.56%±6.18%；16-cell活检7.93%±1.80%，对照46.08%±4.49%），表明猪卵裂期胚胎对活检高度敏感。随后对day-6.5囊胚进行激光辅助TE活检，24 h后囊胚再扩张率83.79%±8.38%，显示影响较小。DAPI染色显示平均获得约9.5个TE细胞，满足人类囊胚植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing, PGT）的5–10 TE细胞需求。免疫荧光比较活检与非活检囊胚，总细胞数、CDX2阳性TE细胞数、KLF4阳性ICM细胞数和ICM/TE比率均无显著差异（P > 0.05）。结论：猪囊胚TE活检是稳健且兼容EGS的采样技术。
2. 多重置换扩增方案的优化：研究人员以五头已知SNP芯片数据的候选猪成纤维细胞构建SCNT胚胎，对TE活检细胞进行MDA和80 K芯片分型，并与供体芯片数据比较。凝胶电泳显示约15,000 bp主带和2,500–15,000 bp弥散条带。50-μL和25-μL体系DNA浓度、SNP检出率和基因型一致性无显著差异，表明反应体积可减半至25 μL。整个SCNT囊胚（平均40细胞）与TE活检细胞（平均9.5细胞）的DNA浓度和分型参数无显著差异。调整裂解和扩增时间发现，12-min裂解显著提高DNA浓度，10-h扩增组基因型一致性96.96%±1.59%，显著高于8-h对照。结论：10-min细胞裂解、10-h PCR扩增和25-μL反应体系为猪胚胎基因分型的优化MDA条件。
3. 不同细胞类型DNA产量评估：研究人员从16头Duroc和18头Yorkshire猪体细胞构建SCNT囊胚并获取TE活检细胞，设置bulk cell组（>10
5体细胞）、low-input cell组（6个体细胞）和TE活检细胞组（平均9.5胚胎细胞）。低输入和TE组用改良MDA扩增。凝胶电泳显示所有组均获高质量基因组DNA，bulk组为单一条带，低输入和TE组呈MDA特征性弥散条带。DNA浓度分别为131.28±91.60、134.08±67.54和120.22±52.08 ng/μL，总DNA产量分别为6.56±4.58、6.70±3.38和6.01±2.60 μg，组间无显著差异（P > 0.05）。结论：MDA可从猪早期胚胎获得足够基因组DNA。
4. 不同细胞类型SNP基因分型性能评估：用80 K SNP阵列对Duroc和Yorkshire三组细胞分型。TE活检组存在染色体缺失片段，Duroc和Yorkshire分别丢失227.08±164.16片段（含943.85±712.85 SNPs）和206.00±86.40片段（含811.50±372.31 SNPs），低输入和TE组染色体缺失片段数显著高于bulk组（P < 0.05）。所有组平均SNP检出率>97%，bulk组显著更高（P < 0.05）。基因型一致性在Duroc中bulk为99.95%±0.02%、low-input为98.13%±5.56%、TE为95.59%±9.49%，Yorkshire分别为96.82%±8.99%、98.14%±6.11%、95.90%±8.89%，组间和品种间无显著差异。结论：MDA扩增DNA可支持稳健可靠基因分型。
5. 不同细胞类型GEBVs评估：将一致性>90%的芯片数据用于计算age at 100 kg（AGE）、feed conversion ratio（FCR）和backfat thickness（BF）的GEBVs，采用GBLUP和Bayesian模型。所有三种细胞类型GEBVs与供体猪正相关。GBLUP下Duroc AGE、FCR、BF相关系数范围0.937–0.998、0.997–1.000、0.945–0.999；Yorkshire为0.894–0.934、0.930–0.999、0.825–0.997。Bayesian下Duroc为0.577–0.851、0.993–1.000、0.956–0.999；Yorkshire为0.797–0.919、0.910–0.997、0.696–0.999。TE活检细胞与bulk细胞间无显著差异（P > 0.05）。某些TE活检组相关性较低，Bayesian模型标准差高于GBLUP。遗传力估计BF最高（Duroc 0.535，Yorkshire 0.552），AGE为0.276和0.308，FCR为0.262和0.210。结论：扩增胚胎细胞基因组信息能有效反映个体猪遗传育种值，GBLUP在当前条件下更稳定。
6. 克隆猪与供体猪GEBVs评估：四头Duroc克隆后代及其供体猪用80 K SNP阵列分型。克隆后代SNP检出率超过99%，供体为100%，平均基因型一致性>92%。遗传力在克隆与供体间相当：AGE为0.357与0.358，BF为0.626与0.626，loin muscle area（LMA）为0.543与0.544。GBLUP模型下AGE、BF、LMA的GEBVs相关性分别为1.00、0.99、1.00。结论：克隆猪能有效复制供体猪遗传潜力和生长性能，间接证明经SCNT建立EGS可行。
讨论部分总结：EGS受人类辅助生殖PGT启发，核心目标是在胚胎移植前获得基因组信息，实现最早阶段选择育种；与PGT优先避免疾病不同，家畜EGS侧重最大化遗传增益和生产效率。研究人员围绕三个问题建立并评估整合流程：胚胎活检是否损害发育、低输入DNA是否适合分型、胚胎育种值是否反映后代性能。结果表明供体猪、克隆胚胎及其后代基因组信息高度一致，首次提供猪EGS可行性的证据。关于活检，反刍动物和人类卵裂期活检影响小，但猪卵裂期活检显著损害发育，可能与猪在8-cell阶段即开始致密化、细胞间接触已建立有关，因此囊胚期TE活检更合适。关于WGA，MDA比多重退火成环循环（multiple annealing and looping-based amplification cycles, MALBAC）具有更高保真性和等位基因分型适用性，本研究中扩增DNA SNP检出率>97%。关于模型，Bayesian模型对扩增偏倚和缺失/错配更敏感，GBLUP通过基因组关系矩阵整合全基因组标记，更稳健。研究局限是使用SCNT胚胎而非受精胚胎验证，未来需扩展至受精胚胎及后代。提出商业流程包括采集受精囊胚、TE活检、MDA、SNP分型和GEBV预测、移植高GEBV胚胎、收集仔猪数据验证。尽管增加复杂性和成本，但生殖生物技术和分型成本下降有望提高可行性。
结论翻译：总之，本研究建立了猪EGS的完整工作流，包括基因组采样、扩增和遗传分析。结果表明，猪胚胎基因组能够准确预测个体猪未来的生产性能。除SNP阵列分析外，引入全基因组测序可能进一步提高EGS准确性。例如，结合下一代测序的高精度变异检测和第三代测序的长读长能力，可为数量性状位点（quantitative trait locus, QTL）定位和因果变异分析提供互补优势，从而增强复杂性状遗传分析的分辨率。此外，当前研究仍缺乏克隆胚胎与对应克隆猪之间的大规模关联分析、正常受精胚胎及其后代的EGS验证，以及其他具有不同遗传架构的重要生产性状。未来研究应聚焦于收集更多数据并解决目前限制EGS常规商业应用的低效率瓶颈。
