恒河河流生态系统噬菌体多样性分析：基于宏基因组测序的见解

《International Microbiology》：Analysis of bacteriophage diversity in Ganga river ecosystem: insights from metagenome-based sequencing

恒河及其支流的水体是印度北部主要的淡水资源，但由于未经处理的污染性工业和生活污水的持续排放，该水体经历了严重的生态退化，导致化学和微生物污染负荷增加。水是数百万人的基本需求，并支撑着一个包含多种微生物物种的复杂生态系统。其中，噬菌体对于控制细菌种群和微生物群落动态至关重要。目前对恒河中噬菌体多样性和功能的了解甚少。研究人员利用前沿的宏基因组（metagenomic）技术，探索河流中病毒（特别是噬菌体）的多样性，提供了噬菌体种群及其生态功能的真实图景。通过高通量测序（high-throughput sequencing）生成宏基因组数据集，用于确定噬菌体序列、病毒基因组相似性和潜在功能。初步发现表明噬菌体存在高度多样性。结果鉴定出三个噬菌体科（Casjensviridae、Rountreeviridae 和 Peduoviridae），这些科的噬菌体可感染多种细菌。研究结果为淡水生态系统的噬菌体生态学提供了重要见解，强调需要更深入地研究水生环境中的噬菌体-细菌相互作用。深入了解恒河中噬菌体的多样性及其作用，有助于开发噬菌体驱动的环境监测和管理方法，尤其是在解决污染、富营养化和抗生素耐药性等问题方面。这些宏基因组结果为研究环境噬菌体与病毒提供了基因组学基础，有助于可持续水质管理和基于噬菌体的治疗干预措施的开发。

恒河是印度北部最重要的淡水资源，发源于喜马拉雅甘戈特里冰川，全长2525公里，流经北阿坎德邦、北方邦、比哈尔邦和西孟加拉邦。恒河流域是世界第16大流域，也是人口最多的流域，具有独特的自然地理特征。然而，近几十年来，快速工业化和城市化使水质显著恶化。例如，坎瑙季至安拉阿巴德之间的河段每日接收约12222百万升生活废水和2500百万升工业废水，大肠菌群计数显示有机污染和病原体是主要问题。水中的微生物群落包括大量噬菌体，这类病毒能感染并裂解细菌，在控制细菌种群和调节微生物群落动态中发挥关键作用。地球上病毒数量估计约10³¹，噬菌体因具有特异性感染细菌的能力，成为抗生素耐药时代的潜在治疗工具。1896年，Hankin就发现恒河水具有滤过性和热不稳定性抗菌活性，可限制霍乱传播。尽管噬菌体的生态重要性已被认识，但恒河上游流动水体中的噬菌体组尚未被系统研究。因此，本研究旨在利用宏基因组测序技术分析恒河哈里瓦尔地区病毒尤其是噬菌体的多样性和系统发育关系。

研究人员从哈里瓦尔三个具有高人为活动的采样点（Daksheshwar Mahadev寺庙、Har ki Pauri、Chandi Devi Ghat）采集水样。所有样品在4°C下转移至实验室，等体积混合后保存于-20°C。使用商业试剂盒提取总DNA和总RNA，RNA逆转录为cDNA后与DNA片段一同构建宏基因组文库。文库经KAPA HyperPlus试剂盒片段化至600 bp左右，进行末端修复、加A尾、连接接头和扩增。使用Illumina HiSeq 4000平台进行双端测序（读长151 bp）。原始reads经FastQC v0.11.9评估质量，然后用fastp v0.20.1进行修剪（参数包括前端切除3个碱基、最小长度50、Phred质量阈值30等）。经过滤后的高质量reads用Kraken2 v2.0.8与NCBIRefSeq数据库比对，进行物种分类。相对丰度基于read counts估计，但研究人员指出该法可能受基因组大小影响。系统发育分析采用ETE3和VICTOR软件。所有测序数据已提交至NCBI（BioProject PRJNA1207791，BioSample SAMN46169521，SRA SRR31978508）。

研究结果分三部分。

序列生成。高通量测序共获得22.4百万条序列，GC含量59%，平均读长151 bp，无显著接头污染。经Kraken2分类，共鉴定出6543种病毒，其中病毒相关序列reads为549,515条。该深度足以捕捉环境中主要的病毒类群。

病毒和噬菌体的分类多样性。在门水平共鉴定出17个病毒门。其中最占优势的门为Uroviricota（3,575条reads），该门包含有尾噬菌体。Negarnaviricota（474）和Pisuviricota（460）次之。Artverviricota（361）和Kitrinoviricota（338）也有一定丰度。在纲水平，Caudoviricetes以3,575条reads占据主导，其余纲如Revtraviricetes（360）、Pisoniviricetes（287）等远远低于它。在目水平，“未分类”类群含1,488条reads，说明有大量未鉴定病毒。已分类目中Crassvirales（867）和Kirjokansivirales（795）多样性最高，其次为Thumleimavirales（416）和Blubervirales（267）。在科水平，Casjensviridae科以516,163条reads独占鳌头，远高于第二名Rountreeviridae（10,094）和第三名Peduoviridae（5,734）。其余科如Autographiviridae（2,614）、Kyanoviridae（1,126）等丰度相对较低。在属水平，未分类属（300,671）和Chivirus属（205,535）占绝对优势，Copernicusvirus（8,607）、Zhonglingvirus（1,818）等次之。在种水平，前三种优势种为Chivirus iEPS5（300,245）、Valbvirus ValB1MD2（124,213）和Andhravirus andhra（68,758）。从第四位BeAn 58058 virus（8,381）开始丰度陡降，但整体仍显示出极高的病毒多样性。这种少数高丰度类群和大量稀有类群并存的模式，可能反映出噬菌体种群的偏斜，同时也是生态繁荣的明确标志。

已鉴定噬菌体和病毒的系统发育分析。研究人员利用ETE3对前25个最丰富物种构建了系统发育树，发现Pandoravirus属有5个物种（Neocaledonia、Macleodensis、Inopinatum、Salinus、Dulcis）进入前25，均为未分类的dsDNA病毒。Papiine betaherpesvirus 3和Ostreid herpesvirus 1同属Herviviricetes纲和Herpesvirales目，因而聚在一起。属于Caudoviricetes纲的Rosenblumvirus CSA13、Andhravirus andhra、Zhonglingvirus SAP012和Chivirus iEPS5构成一个分支，其中后两者同属Casjensviridae科，亲缘关系更近。另外，Elvirus EL、Polybotosvirus Atuph07、Efquatrovirus LY0322、Pseudomonas phage Psa21和Valbvirus ValB1MD2也属于Caudoviricetes纲。Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus与Tipula oleracea nudivirus同属Lefavirales目，关系较近。VICTOR的核苷酸树进一步支持上述分类关系。

讨论部分指出，水生病毒因其难培养且缺乏通用标记基因，宏基因组学是研究其多样性的重要工具。本研究结果与已有报道的多种功能噬菌体相呼应：Chivirus iEPS5为感染沙门氏菌的鞭毛噬菌体；Valbvirus ValB1MD2可杀灭溶藻弧菌；Bacteriophage Andhra可抑制葡萄球菌生长；Staphylococcus phage CSA13具有抗生物膜潜力；Enterococcus phage LY0322感染粪肠球菌；EL噬菌体产生的肽聚糖降解酶可裂解革兰氏阴性菌；Agrobacterium phage Atu_ph07可特异性感染根癌农杆菌，用于生物防治；Pseudomonas phage Psa21可用于防治猕猴桃细菌性溃疡病。这些噬菌体在医学、农业和环境领域具有应用前景。研究还发现噬菌体可能携带与细菌毒力和抗生素耐药性相关的基因，提示其在细菌进化中的生态作用。结论认为，本研究全面揭示了恒河噬菌体组的高多样性和生态功能，为淡水生态系统的病毒生态学提供了新认识，也为开发基于噬菌体的环境监测和管理策略奠定了基础。通过进一步研究噬菌体-细菌互作，未来可利用噬菌体工程应对污染、富营养化和抗生素耐药性等挑战。