《Frontiers in Microbiology》：Integrative phenotypic and transcriptomic validation of an alveolar-like macrophage model reveals early host–pathogen dynamics during Aspergillus fumigatus infection
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原发性肺泡巨噬细胞（primary alveolar macrophages，pAMs）对于快速清除分生孢子及维持肺稳态至关重要。然而，烟曲霉（Aspergillus fumigatus）仍是免疫缺陷患者侵袭性肺曲霉病（invasive pulm
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原发性肺泡巨噬细胞（primary alveolar macrophages，pAMs）对于快速清除分生孢子及维持肺稳态至关重要。然而，烟曲霉（Aspergillus fumigatus）仍是免疫缺陷患者侵袭性肺曲霉病（invasive pulmonary aspergillosis，IPA）的首要病因，而控制真菌清除与侵袭的机制仍知之甚少。尽管pAMs可从人类供体中分离，但其在体外感染研究中的广泛应用受限于可获得性低及培养维持的技术挑战。在本研究中，研究人员成功将先前建立的单核细胞来源肺泡样巨噬细胞（alveolar-like macrophage，ALM）模型应用于探究烟曲霉攻击下的早期宿主-病原体相互作用。鉴于GM-CSF对维持肺泡巨噬细胞身份和功能的需求，研究人员纳入了GM-CSF分化巨噬细胞（GM-M）作为广泛采用的参考模型。从人肺活检组织中分离的原发性肺泡巨噬细胞（pAM）被用于验证ALM模型的生理相关性。综合表型、转录组及功能分析表明，在稳态和感染条件下，ALMs在多个时间点和真菌负荷下均与pAMs高度相似。值得注意的是，真菌双RNA测序揭示了在与ALM相互作用期间真菌毒力相关因子的显著上调，而这一现象在GM-M共培养中未被观察到。综上，这些发现支持将ALMs作为一种稳健、实验易得且具有生理相关性的体外模型，用于研究烟曲霉早期感染，为肺泡界面的宿主-病原体动态提供了新的见解。
论文解读文章
一、研究背景与问题
侵袭性真菌感染，尤其是侵袭性肺曲霉病（invasive pulmonary aspergillosis，IPA），仍然是免疫缺陷患者发病和死亡的主要原因。烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种常见于土壤和腐烂有机质中的腐生霉菌，产生2–3 μm的小型气传分生孢子。其耐热性、广泛的pH适应性以及疏水性分生孢子表面使其成为成功的机会性气传病原体。吸入后，分生孢子可到达肺泡，嵌入肺泡上皮表面活性层并在数小时内开始萌发。在免疫缺陷个体中，这可能导致危及生命的IPA，尤其对中性粒细胞减少症、接受化疗或移植以及长期皮质类固醇治疗的患者尤为危险。
气道上皮细胞和原发性肺泡巨噬细胞（primary alveolar macrophages，pAMs）构成抵御烟曲霉的第一道防线。作为肺泡微环境中的优势免疫细胞群体，pAMs通过分生孢子吞噬、细胞因子和抗菌肽产生以及活性氧生成等多种抗真菌机制，协调早期免疫应答并直接促进病原体清除。然而，尽管pAMs在烟曲霉早期免疫应答中发挥核心作用，其潜在机制仍不完全清楚。
现有实验方法面临重大局限：pAMs在体外培养过程中迅速丧失组织特异性表型，其分离受限于产量低、供体变异性大以及对遗传操作的适应性有限。为解决这些挑战，近期研究建立了单核细胞来源的肺泡样巨噬细胞（alveolar-like macrophage，ALM）模型，该模型可重现pAMs的关键特征，同时提供更好的可扩展性和实验可及性。尽管ALM模型此前已在细菌和病毒感染环境中得到验证，但其对真菌病原体的适用性尚未被研究。因此，本研究旨在将该ALM模型应用于烟曲霉感染研究，系统验证其生理相关性，并利用双RNA测序技术揭示早期宿主-病原体相互作用的动态过程。
二、主要关键技术方法
研究人员将CD14+单核细胞从健康成人外周血单个核细胞中分离，分别通过GM-CSF、IL-10、TGFβ和Curosurf组合分化获得ALMs，以及单独GM-CSF分化获得GM-Ms。pAMs从德国维尔茨堡大学医院提供的新鲜人肺活检组织中分离，排除重度吸烟者样本。研究人员采用流式细胞术和免疫荧光分析表征巨噬细胞表型标志物；利用FLARE荧光报告菌株结合钙荧光白（calcofluor white，CFW）染色评估吞噬和胞内杀伤效率；通过双RNA测序（dual RNA-sequencing）同时分析宿主和真菌转录组，使用GEO2RNAseq流程处理数据，结合四种统计工具鉴定差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）；运用基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析、STRING数据库蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建以及多种计算工具（SignalP 6.0、TargetP 2.0、DeepTMHMM 1.0等）预测宿主-病原体互作相关蛋白特征；通过多重细胞因子检测和酶联免疫吸附测定（ELISA）验证蛋白水平表达；采用菌落形成单位（colony forming unit，CFU）分析评估真菌存活。
三、研究结果
3.1 肺泡样巨噬细胞在稳态和烟曲霉感染条件下与原发性肺泡巨噬细胞相似
形态学分析显示，pAMs和ALMs均呈现以圆形为主的形态，而GM-Ms则更扁平、更细长。流式细胞术检测表明，pAMs细胞体积更大、自发荧光更高。标志物表达分析显示，ALMs的HLA-DR-DP-DQ和CD68表达水平与pAMs相当，CD206和CD11b呈中间表达水平，比GM-Ms更接近pAMs。功能层面，在MOI 1感染6小时和MOI 5感染9小时条件下，pAMs和ALMs均表现出稳健的细胞因子诱导（包括TNF、CCL3、CCL4、IL-1β和IL-8），而GM-Ms反应有限且基线水平较高，提示其处于预活化状态。
3.2 ALMs高效吞噬烟曲霉分生孢子
利用FLARE荧光报告菌株，研究人员发现ALMs在所有测试条件下（MOI 0.5–3，2小时和6小时）均比GM-Ms更快速、更高效地吞噬分生孢子。尽管吞噬动力学存在差异，两种巨噬细胞群体的杀伤效率总体相当。ALMs的杀伤效率随时间和真菌负荷增加而提高，表明其在高真菌负荷下仍能维持持续的吞噬活性。Dectin-1和TLR2两种模式识别受体在ALMs和GM-Ms表面的表达无显著差异。
3.3 ALMs对烟曲霉产生快速且稳健的促炎转录反应
双RNA测序分析显示，ALMs在感染6小时和9小时后分别有243个和438个差异表达基因，而GM-Ms在6小时仅有16个DEGs，9小时增至283个。ALMs在感染后迅速上调TNF、CCL3、CCL4、IL-8、CXCL9、CXCL10等促炎介质，以及CD274、CD83和ICAM1等免疫调节标志物。通路分析揭示ALMs在感染后抑制氧化磷酸化，同时激活NF-κB和TNF信号通路及细胞募集相关通路。未感染的ALMs富集pAMs特征基因，而GM-Ms高表达FCN1和FN1（募集巨噬细胞或单核细胞标志物），表明GM-Ms更接近血液募集巨噬细胞而非pAMs。蛋白水平验证确认ALMs比GM-Ms分泌显著更高水平的TNF、CCL3、CCL4和CXCL10。
3.4 烟曲霉在与ALMs相互作用期间增强反防御反应
真菌转录组分析显示，与ALMs相互作用时，烟曲霉在9小时出现2,325个DEGs，显著高于与GM-Ms相互作用时的1,331个DEGs。真菌在与ALMs接触时强烈上调应激适应和免疫逃逸相关基因，包括过氧化氢酶cat1（Afu3g02270）、胶霉毒素生物合成通路关键组分（gliZ/Afu6g09630、gliA/Afu6g09710、gliG/Afu6g09690）以及过敏原编码基因aspf1（Afu5g02330）和aspf2（Afu4g09580）。通路分析显示，6小时时真菌抑制生长相关过程（麦角固醇生物合成和核分裂），9小时时转向激活毒力相关程序（胶霉毒素产生、次级代谢物生物合成和IgE结合通路）。qRT-PCR验证了gliZ、cat1和cipC的表达模式。
3.5 宿主-病原体互作网络揭示ALMs与烟曲霉的协调感染反应
基于双转录组数据构建的预测PPI网络显示，烟曲霉感染持续调节宿主有氧电子传递链相关蛋白。宿主网络以TNF信号相关蛋白（包括ICAM1、TLR2、CSF1、LILRB1和CXCL10）为中心，6小时时呈现明显的CXCL10相关炎症特征，9小时时CSF2受体亚基表达增强。真菌网络在6小时以半乳糖代谢和蛋白质翻译相关蛋白为主，9小时转向应激适应、呼吸体相关蛋白和活性氧响应特征，包括抗氧化酶Cat1和超氧化物歧化酶SodB。
3.6 真菌过敏原在巨噬细胞相互作用中促进免疫逃逸
研究人员用烟曲霉野生型（WT；CEA17 ?akuB KU80）及?aspf1和?aspf2敲除突变株感染pAMs、ALMs和GM-Ms。结果显示，Asp f1缺陷突变株感染在某些巨噬细胞类型中诱导了更强的细胞因子反应。CFU分析表明，?aspf1和?aspf2的菌落回收率均显著低于WT，表明在缺乏这些过敏原时ALMs介导的真菌杀伤增强。对照实验排除了真菌生长或吞噬摄取差异的影响。
四、讨论与结论
本研究表明，ALM模型在表型和功能上高度重现pAMs的关键特征，包括圆形形态、标志物表达谱、稳态下的平衡状态以及感染时快速诱导的促炎反应。与GM-Ms相比，ALMs对烟曲霉的吞噬更快更高效，转录激活更迅速协调，且能触发真菌更强的反防御反应，包括胶霉毒素生物合成、氧化应激防御（cat1）和犬尿氨酸代谢等免疫逃逸通路的激活。研究还揭示了过敏原Asp f1和Asp f2在早期感染中促进真菌持续存在的功能，其缺失增强巨噬细胞介导的真菌杀伤并适度增强细胞因子反应。
ALMs与pAMs的相似性在多个时间点和真菌负荷下均成立，支持ALMs作为研究烟曲霉早期宿主-病原体相互作用的稳健、实验易得且生理相关的体外模型。双RNA测序策略捕获了宿主防御与真菌适应之间的动态相互作用，为肺泡界面的早期感染动态提供了新的见解。该模型弥补了pAMs来源受限和GM-Ms代表性不足的缺陷，为研究人类特异性抗真菌免疫反应和潜在毒力机制提供了有价值的实验平台。
