小麦硫氧还蛋白（TRXs）作为激素响应性氧化还原调控因子：转录组学与结构解析

《Frontiers in Plant Science》：Thioredoxins as hormone-responsive redox regulators in wheat: transcriptomic and structural insights

硫氧还蛋白（thioredoxins, TRXs）是参与胁迫响应和植物发育的小型核心氧化还原蛋白，但其激素依赖性调控仍表征不足。在本研究中，研究人员以拟南芥（Arabidopsis thaliana）TRXs为同源序列，对小麦（Triticum aestivum, Ta）TRX家族进行了全基因组鉴定。系统发育分析共鉴定出48个TRXs，包括22个典型TRXs、22个非典型TRXs和4个硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductases, TRs）。与拟南芥基因组相比，小麦中鉴定出的类别保守；然而，未鉴定出额外类别。为评估小麦TRX基因在激素处理包括脱落酸（abscisic acid, ABA）、乙烯（ethylene, ET）、吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid, IAA）和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）下的调控，研究人员利用基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）数据集进行了计算机模拟（in silico）分析。转录组分析和定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）验证显示，非典型TRXs对激素的响应强于典型TRXs和TRs。在这些非典型TRX成员中，非典型半胱氨酸/组氨酸富集硫氧还蛋白（atypical cysteine/histidine rich thioredoxin, ACHT）、32 kDa叶绿体干旱胁迫蛋白（chloroplast drought stress protein of 32 kDa, CDSP32）、核氧还蛋白（nucleoredoxin, NRX）和TRX-L3类群对激素响应最强。ABA强烈上调TaACHT4.2基因，而TaNRX1.1响应IAA和ET。另一方面，ABA、IAA、ET和MeJA下调TaCDSP32.1、TaNRX1.2、TaNRX1.3和ACHT成员。分子对接分析提示所选非典型TRXs与ABA、IAA和MeJA之间存在潜在相互作用。多结构域TRXs，如TaCDSP32.1和TaNRX1.1，对ABA和IAA表现出高亲和力，而TaTRX-L3.1.3对MeJA表现出高亲和力。该研究强调了表征较少的非典型TRXs作为小麦激素响应性氧化还原调控节点的重要性和潜在功能，并为在激素和胁迫条件下以及植物发育过程中进行未来功能验证提供了基础。

研究背景方面，小麦（Triticum aestivum）生长和发育受热、干旱和氧化胁迫强烈影响，这些过程由植物激素依赖途径调控，包括脱落酸（abscisic acid, ABA）、赤霉素（gibberellic acid, GA）和生长素（auxin, AUX）信号。这些途径与硫氧还蛋白（thioredoxins, TRXs）和谷氧还蛋白系统互作，调节发育、抗氧化防御、代谢及胁迫下细胞氧化还原稳态。TRXs存在于光合和非光合生物中，分为典型TRXs、非典型TRXs和硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductases, TRs）。典型TRX具有保守Cysteine–Glycine–Proline–Cysteine（CGPC）活性位点，非典型TRX具有CXXC活性位点。TRXs通过硫醇-二硫键交换维持氧化敏感转录因子、受体和代谢酶活性，参与激素和叶绿体信号、叶绿体发生、种子萌发、胚胎发生和开花。尽管对TRX系统和植物激素信号兴趣增长，TRXs的激素调控仍理解不足。因此研究人员开展比较基因组分析，基于拟南芥（Arabidopsis thaliana）TRXs同源鉴定小麦TRXs，分析公共转录组数据中激素处理响应，进行qRT-PCR验证，并用分子对接预测激素结合亲和力与潜在位点，以增强小麦TRX系统功能注释，鉴定激素响应TRXs，为未来发育和胁迫研究提供基础。研究人员得出，非典型TRXs比典型TRXs和TRs更响应激素，并鉴定出TaACHT4.2、TaNRX1.1、TaCDSP32.1和TaTRX-L3.1.3等候选，这为理解小麦氧化还原调控与激素信号关系及未来遗传操作提供依据。

关键技术与方法方面，研究人员以拟南芥非典型TRXs、典型TRXs和TRs参考蛋白为查询，在Phytozome数据库中对小麦基因组组装进行BLAST检索，按覆盖度、一致性和保守催化活性位点筛选同源序列；用TargetP 2.0、WoLF PSORT和PSORT预测亚细胞定位；用MEGA 12以邻接法（neighbor-joining, NJ）构建系统发育树。表达分析使用GEO数据库GSE103430，该数据集来源于Qi et al. (2019)生成的小麦激素处理转录组（GeneChip Wheat Genome Array），以|log₂FC|≥0.5筛选并构建热图，并用qRT-PCR验证。三维结构通过PDB同源、Phyre v2.2和D-I-TASSER预测，ERRAT和PROCHECK评估；分子对接用AutoDock Vina、PyRx和UCSF ChimeraX，配体结构来自PubChem和ChEBI。

研究结果中，3.1 小麦硫氧还蛋白家族的全基因组鉴定与系统发育分析：基于转录组数据和拟南芥AtTRX查询，鉴定出22个典型TaTRXs、22个非典型TaTRXs和4个TaTRs；典型TaTRXs包括f、m、y、o、h和TDX类型，非典型TaTRXs包括ACHT、CDSP32、Like3（L3）、Clot、CXXS、TRX-c和NRX类型。亚细胞定位预测显示，典型f、m、y、TDX及非典型CDSP32、ACHT、TRX-Like3和TRX-c为叶绿体，o为线粒体，h、CXXS和CLOT为胞质，NRX为细胞核。小麦与拟南芥主要类型保守，差异源于基因复制和多倍化扩张而非新类型出现。3.2 催化基序保守性与结构稳定性：尽管存在大量复制，TaTRXs保持与拟南芥相似的高度保守氧化还原中心，典型TRXs具WCGPC签名。多数非典型TRXs活性中心保守，但TaACHT6类为SCGSC而非拟南芥ACGSC，CXXS类为WCVTS而非WCIPS，TaFTRA.2为EAEHAPK而非RCDIAVK。这表明特定非典型TRX-c和TR类可能功能分化，进化多样化主要涉及调控区而非蛋白核心。3.3 小麦TaTRX基因对植物激素的转录调控：研究人员分析GEO GSE103430中ABA、MeJA、IAA、CK、GA、ET和SA处理数据，发现激素主要影响典型和非典型TaTRX基因，TaTR似乎不显著调控；ABA刺激最强，SA和GA未诱导显著可检测调控，qRT-PCR确认上调和下调基因。3.3.1 激素处理下TaTRX基因选择性上调：热图聚类分为上调和下调基因。上调基因中，仅非典型核氧还蛋白TaNRX1.1在ET和IAA下显著上调，叶绿体TaACHT4.2在ABA下显著上调；典型TaTRXs和TaTRs无显著上调。qRT-PCR确认TaNRX1.1响应ET和IAA，不响应ABA、MeJA、CK、GA和SA；TaACHT4.2仅响应ABA。讨论认为TaNRX1.1上调强化核水平激素响应氧化还原调控，TaACHT4.2特异上调提示ABA介导叶绿体氧化还原调控。3.3.2 激素处理下TaTRX基因差异性下调：ABA下调更广，包括TaNRX1.2、TaNRX1.3、TaACHT6.1、TaACHT6.4和TRX-h1.4；qRT-PCR确认这些基因在ABA下显著抑制。ET下调TaCDSP32.1和TaACHT6.3。TaCDSP32.1还在MeJA和IAA下受抑制，TaACHT6.3也在ABA、ET、IAA下受抑制。讨论认为这些模式反映核、胞质和叶绿体氧化还原调控重编程，可能影响花发育和种子形成早期氧化还原稳态。3.4 分子对接支持硫氧还蛋白激素响应性：研究人员对显著受激素刺激或抑制的TaTRX-L3.1.3、TaCDSP32.1、TaACHT4.2和TaNRX1.1进行对接。由于ET为气态非极性且TRXs无已知Cu(I)依赖乙烯结合位点，对接限于ABA、IAA和MeJA。3.4.1 非典型硫氧还蛋白蛋白三维结构预测：TaACHT4.2、TaTRX-L3.1.3、TaCDSP32.1和TaNRX1.1呈现硫氧还蛋白折叠，中心β-折叠被α-螺旋包围。TaTRX-L3.1.3和TaACHT4.2为单硫氧还蛋白结构域，活性位点分别为WCRKC和GCGGC；TaCDSP32.1含两个硫氧还蛋白结构域、单一活性位点HCGPC；TaNRX1.1含三个硫氧还蛋白结构域、两个活性位点WCGPC和WCPPC。部分TaACHT6成员因结构质量低和亲和力差未展示。3.4.2 非典型硫氧还蛋白与激素的分子对接分析：对接显示TaACHT4.2、TaCDSP32.1、TaTRX-L3.1.3和TaNRX1.1对ABA和IAA具有预测高亲和力。TaCDSP32.1和TaNRX1.1对ABA和IAA亲和力最高；TaCDSP32.1结合能为ABA ?7.5 kcal/mol、IAA ?7.3 kcal/mol，TaNRX1.1为ABA ?7.1 kcal/mol、IAA ?6.1 kcal/mol。多结构域提供多个口袋稳定ABA（约11–13 ?）、IAA（约8–9 ?）和MeJA（约10–11 ?）。结合位点分析显示，TaACHT4.2对ABA和MeJA使用相同口袋，IAA结合于不同口袋；TaCDSP32.1、TaTRX-L3.1.3和TaNRX1.1对ABA、IAA和MeJA在同一区域结合。3.4.2.1 预测的脱落酸结合位点：ABA含羟基、酮基和羧酸基，需多样口袋。预测结合位点主要由中性、极性、芳香和碱性氨基酸组成。TaACHT4.2为混合极性和疏水口袋，TaCDSP32富含Lys可稳定ABA羧基，TaTRX-L3.1.3和TaNRX1.1以疏水和芳香残基为主稳定ABA非极性区。TaCDSP32.1预测口袋最有利，与其最强ABA结合亲和力一致。3.4.2.2 预测的吲哚-3-乙酸结合位点：IAA含疏水吲哚环和羧基；预测口袋富含疏水和芳香残基以稳定吲哚环，极性或带电残基与羧基作用。TaCDSP32.1和TaNRX1.1具有最广泛疏水和芳香口袋，TaACHT4.2和TaCDSP32.1中Lys和Arg可能提供静电稳定。3.4.2.3 预测的茉莉酸甲酯结合位点：MeJA为茉莉酸挥发性甲酯，含环戊酮环、戊烯侧链和甲酯基。预测口袋富含疏水和芳香残基，包括Leu、Val、Pro、Ala、Phe和Tyr，可稳定环戊酮环和戊烯侧链；Gln、Lys、His和Glu可与含氧基团作用。TaTRX-L3.1.3和TaNRX1.1具有最广泛疏水和芳香口袋，而TaACHT4.2和TaCDSP32.1口袋较小且疏水性较低，支持叶绿体TaTRX-L3.1.3和核TaNRX1.1为潜在MeJA互作蛋白。3.5 结论与未来展望：本研究对小麦典型和非典型硫氧还蛋白及硫氧还蛋白还原酶进行了整合表征，包括全基因组鉴定、分类、激素响应表达模式和与植物激素的预测相互作用。比较基因组分析显示，拟南芥中鉴定的所有类别在小麦基因组中保守，尽管若干类别因小麦多倍化而扩张。所有氧化还原中心完全保守，除TaACHT6特异SCGSC签名。激素表达谱显示，非典型TaTRXs比典型TaTRXs和TaTRs更具响应性。TaACHT4.2、TaNRX1.1、TaCDSP32.1和TaTRX-L3.1.3被鉴定为激素响应候选。分子对接进一步支持它们与ABA、IAA和MeJA的潜在相互作用，提示这些蛋白可能参与叶绿体和核区室的激素依赖氧化还原过程。这些发现为理解小麦中硫氧还蛋白介导的氧化还原调控与植物激素信号之间的关系建立了基因组和功能基础，并鉴定出有前景的靶标，用于未来生化验证和遗传操作，以改善作物生长、发育和抗逆性。讨论部分总体强调，小麦TRX系统核心结构保守，变异主要与多倍化扩张和调控区相关；非典型TRXs是激素响应重点，ABA、ET、IAA和MeJA通过上调和下调不同亚细胞区室成员参与氧化还原重编程；分子对接从结构层面支持TRX与ABA、IAA和MeJA直接互作的可能，尤其是多结构域蛋白可提供多个结合口袋。