CELSR1基因变异与人类发育缺陷：基于细胞黏附与平面细胞极性功能的系统性评估

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Functional assessment of CELSR1 variants associated with human developmental defects

　　

摘要专业翻译 在发育过程中，驱动器官形成和组织模式化的集体性及定向性细胞行为需要相邻细胞间的协调，这一过程受高度保守的平面细胞极性（planar cell polarity，PCP）通路调控。PCP基因功能缺陷可导致从果蝇到小鼠等多种模式生物出现严重发育缺陷，而PCP基因突变与影响神经管和心脏的人类出生缺陷相关。非典型钙黏蛋白Celsr1通过参与细胞-细胞黏附，协调Fz6和Vangl2在相邻细胞PCP连接两侧的不对称定位。然而，CELSR1基因变异是否破坏其功能或参与疾病发病机制仍知之甚少。研究人员利用基于细胞的Celsr1功能检测方法，结合计算机模拟（in silico）建模，对先前在神经管缺陷和先天性心脏病患者中鉴定的17个Celsr1突变进行了检测。在连接富集实验中，研究人员发现13个变异体相对于野生型（WT）在细胞边界表现出改变的富集水平，包括功能缺失（loss-of-function）和功能获得（gain-of-function）两种行为。对选定的Celsr1突变进一步分析揭示了膜流动性缺陷以及PCP蛋白Fz6共招募的紊乱。研究结果将人类出生缺陷相关的Celsr1突变与黏附和PCP功能缺陷联系起来。此外，该研究建立了一个框架，将PCP功能评估与基因组学和计算机模拟预测相结合，以理解与人类发育障碍相关的遗传变异对病理生理的影响，并深入了解Celsr1在发育过程中的功能。

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研究背景与科学问题

组织形态发生依赖于细胞黏附、极性信号和基因表达通路之间的复杂交叉作用。细胞-细胞黏附和极性缺陷会破坏组织结构，导致一系列人类发育障碍。平面细胞极性（planar cell polarity，PCP）通路在胚胎发生过程中对于组织平面内细胞定向和集体行为（如会聚延伸）至关重要。PCP受损可导致心脏和神经管缺陷、纤毛病变、左右模式缺陷、多囊肾病以及内耳和皮肤模式缺陷等多种严重发育异常。

PCP通路从果蝇到脊椎动物高度保守，其核心是由一组多次跨膜蛋白组成的连接复合体，围绕中央黏附质膜结构域不对称组装。非典型钙黏蛋白Celsr1（果蝇同源物为Flamingo/Fmi）介导同嗜性细胞-细胞黏附，从而桥接细胞间的PCP连接。在哺乳动物皮肤这一研究脊椎动物PCP的关键模式系统中，Celsr1黏附对于Fz6和Vangl2在细胞边界的积累至关重要。携带Celsr1钙黏蛋白重复单点突变的小鼠Crsh突变体研究表明，侧向聚集（即顺式二聚化）对于Celsr1在膜上的稳定性以及组织Fz6和Vangl2在细胞连接处的不对称性均不可或缺。

人类出生缺陷影响约3%的美国新生儿，是美欧婴儿死亡的首要原因，其中神经管缺陷（neural tube defects，NTDs）和先天性心脏病（congenital heart defects，CHDs）最为常见。尽管共享的CELSR1突变在受累个体中罕见，但CELSR1突变在NTD和CHD患者中的发生频率相对较高，在某些患者队列中可高达16%。然而，并非总能明确特定遗传变异是否影响蛋白质功能从而导致发育缺陷，或仅仅是无害甚至有利的多态性。因此，开发能够评估遗传变异相关功能变化的筛选方法至关重要。值得注意的是，许多CELSR1突变定位到参与细胞-细胞黏附并协调PCP的黏附结构域。研究人员旨在利用这些与先天出生缺陷相关的自然突变，确定其对CELSR1黏附和PCP功能的影响。

研究内容与结论

研究人员从小鼠角质形成细胞培养模式系统出发，测试了17个在CHD和NTD患者中鉴定、定位于CELSR1/Celsr1（小鼠）钙黏蛋白重复序列的突变。通过多种功能和结构评估，研究人员揭示了不同疾病相关突变如何在细胞和分子水平扰乱Celsr1行为。研究结果发现，人类疾病相关的Celsr1变异体影响CELSR1黏附功能，并支持将计算机模拟致病性预测工具与实验验证相结合，以加深对CELSR1在发育中功能的理解。

关键技术与方法

研究人员综合运用了多种技术手段。首先，利用多种序列变异预测工具（包括SIFT、PolyPhen-2、FATHMM、MutPred2、CADD、MutationTaster和AlphaMissense）对所有17个突变进行计算机模拟致病性评估。其次，使用AlphaFold2进行结构建模，定位变异在预测钙黏蛋白结构域中的位置，并利用蛋白质数据库（PDB）中来自X射线晶体学研究的结构测量变异残基与最近钙离子的距离。在功能层面，研究人员将人类等效突变引入小鼠Celsr1相应保守残基，在小鼠角质形成细胞中表达后，通过连接富集实验评估细胞-细胞边界的积累；采用荧光漂白后恢复（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）技术检测膜流动性；通过混合细胞实验和共转染实验分析反式和顺式相互作用；并共表达Fz6和Vangl2检测PCP蛋白共招募能力。样本来源为先前研究中鉴定的患者突变队列。

研究结果

疾病相关Celsr1变异体表现出差异性的连接富集。 研究人员通过连接富集实验评估17个突变的功能影响。结果显示，其中13个变异体相对于野生型表现出改变的连接富集水平，包括12个功能缺失（loss-of-function，LOF）突变和1个功能获得（gain-of-function，GOF）突变。EC3-9结构域中的变异体表现出降低或不变的连接富集，而唯一一个GOF突变定位于EC6结构域。计算机模拟预测工具对突变致病性的预测存在显著差异，例如PolyPhen-2和MutationTaster预测15/17个突变致病，而AlphaMissense仅预测4/17个致病。结构分析显示多个变异体靠近EC结构域间连接区，其中6个突变位于钙离子10?范围内。

Celsr1突变体在细胞连接处表现出差异性稳定性。 通过FRAP分析，研究人员发现R614W和A788V突变体表现出显著升高的可移动分数（分别为47.0%和38.9%），与降低的连接富集一致。而R556W和V566M尽管连接富集降低，但可移动分数与野生型相近。GOF突变P885L则表现出降低的膜流动性（10.2%），尽管未达统计学显著。这些数据表明连接富集与膜稳定性并非总是紧密偶联。

Celsr1变异体保留与WT Celsr1相互作用的能力。 通过混合细胞实验检测反式相互作用，所有测试的变异体均保留与野生型在反式构型中相互作用的能力，且野生型的连接富集不受变异体存在的影响。在共转染实验中，所有变异体均能与野生型共富集，表明LOF变异体R556W、R614W和A788V的富集缺陷可被同一细胞内野生型Celsr1的存在所拯救，顺式相互作用未受影响。

Celsr1钙黏蛋白结构域变异体影响Fz6向细胞边界的招募。 除GOF突变P885L外，所有检测的突变均未能将Fz6共招募至细胞边界，Fz6招募较与野生型共表达时显著降低。V566M尽管连接富集与野生型相当，但Fz6共招募降低，提示该突变可能独立于Celsr1同嗜性黏附相互作用而损害Celsr1-Fz6相互作用。相比之下，Vangl2共富集基本不受变异体影响。

讨论与结论

研究讨论指出，区分人类疾病中的因果变异与良性变异、修饰因子或风险等位基因是重大挑战。功能评估与计算机模拟分析相结合为阐明序列变异在发育障碍中的潜在作用提供了有力方法。研究发现多数Celsr1钙黏蛋白重复区突变导致细胞-细胞界面组装和富集缺陷。所有位于钙离子10?范围内的突变均表现出连接富集的功能影响，与钙黏蛋白重复在细胞黏附和PCP复合体建立中的关键作用一致。R614W和A788V的高可移动分数与受损黏附一致，而P885L的更高稳定性提示黏附强度或稳定性在发育过程中可能被精细调控以满足不同胚胎阶段组织模式化需求。Fz6共招募降低提示Celsr1黏附缺陷可能通过减少Fz6招募导致PCP信号缺陷，而Vangl2招募不受影响则支持胞外结构域介导Celsr-Fz相互作用、胞内结构域介导Fmi-Vang相互作用的观点。值得注意的是，体外功能评估结果与计算机模拟致病性评分存在显著差异，综合致病命中评分为6/8时，体外结果与计算机模拟预测的一致性仅为53%，而突变与钙离子的接近度是体外功能影响的最强预测因子。研究结论认为，人类疾病相关变异体影响CELSR1黏附功能，需要进一步开发和表征Celsr1黏附和信号检测方法，以阐明人类疾病中鉴定突变的意义，并最终在脊椎动物发育模型中理解Celsr1黏附和PCP信号如何促进正常人类发育。