《Frontiers in Neuroscience》：Protein glycosylation and glycation in Alzheimer's disease: mechanisms, crosstalk, and therapeutic perspectives
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是全球范围内最常见的神经退行性疾病，其病理特征表现为由淀粉样蛋白-β(amyloid-β, Aβ)肽段组成的细胞外老年斑和由过度磷酸化tau蛋白形成的细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)。尽管经过数十年的研究，AD发病的分子机制仍未完全阐明，且缺乏有效的疾病修饰疗法。蛋白质糖基化(glycosylation)和糖化(glycation)作为两种不同的翻译后修饰，已被证实是AD病理生理过程中的关键参与者。糖基化是一种酶促调控过程，包括N-连接糖基化、O-GlcNAc修饰和O-GalNAc糖基化，可调控淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)的加工过程、tau蛋白的聚集倾向和过度磷酸化、载脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)的功能以及神经炎症信号通路。在AD患者的脑组织、脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)和血浆中已持续检测到异常的糖基化模式，凸显了其作为诊断生物标志物的潜力。相比之下，糖化是还原糖与蛋白质之间发生的非酶促反应，可生成晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)，后者通过与其受体(receptor for AGEs, RAGE)相互作用，促进氧化应激、神经炎症、血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)功能障碍以及Aβ和tau蛋白聚集。本综述系统总结了糖基化和糖化在AD发病机制中作用的最新研究进展、它们与经典病理标志的交叉对话，以及作为生物标志物和治疗靶点的转化价值，为AD的早期诊断和多靶点干预策略提供了新的视角。
4 蛋白质糖基化和糖化概述
在生理和病理条件下，蛋白质通过两种不同的生化途径发生糖介导的修饰：糖基化是一种酶调控的翻译后修饰，而糖化是一种无需酶催化的自发化学反应。这两种过程在反应机制、糖供体来源及其生物学后果方面存在根本性差异。
4.1 酶促糖基化
酶促糖基化是真核生物中最普遍且最复杂的翻译后修饰之一。该过程由特定的糖基转移酶和糖苷酶协同调控，具有高度的位点特异性和聚糖结构多样性。根据聚糖与氨基酸残基之间的连接方式，主要分为N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化起始于内质网(endoplasmic reticulum, ER)，并在高尔基体内经历复杂的修剪和成熟过程。其特征是将聚糖链还原端的N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine, GlcNAc)以共价键连接至靶蛋白天冬酰胺(asparagine, Asn)残基的酰胺氮上，主要发生在高度保守的共有序列Asn-X-Ser/Thr处。N-糖基化在蛋白质折叠质量控制、细胞器间运输、膜定位及受体-配体识别中发挥不可或缺的作用。O-糖基化的核心特征是通过O-糖苷键将聚糖链连接至丝氨酸(serine, Ser)或苏氨酸(threonine, Thr)残基的侧链羟基上。其中，O-GlcNAc修饰发生在细胞质和细胞核内，由一对酶——O-GlcNAc转移酶(O-GlcNAc transferase, OGT)和O-GlcNAcase(OGA)——动态可逆调控。值得注意的是，O-GlcNAc修饰的底物位点与蛋白质磷酸化位点高度重叠，两者可通过直接竞争同一氨基酸位点或通过空间位阻和蛋白质构象改变间接双向调节，这对维持tau等神经元细胞骨架蛋白的稳态至关重要。
4.2 非酶促糖化与AGEs
与受基因和酶严格调控的酶促糖基化不同，非酶促糖化是一种依赖于浓度和时间的自发化学反应。在AD相关的氧化应激微环境中，该非酶促反应被异常加速。
4.2.1 美拉德反应的生化级联
非酶促糖化的核心是经典的美拉德反应。该级联反应包括三个阶段：(1)早期阶段：还原糖的自由羰基与赖氨酸(lysine, Lys)的ε-氨基、精氨酸(arginine, Arg)的胍基或蛋白质N端的α-氨基发生亲核加成，形成可逆的希夫碱(Schiff bases)。(2)中间阶段：希夫碱经缓慢的分子内重排，生成相对稳定但可逆的糖化胺——醛糖来源形成Amadori产物，酮糖来源形成Heyns产物。(3)晚期阶段：Amadori/Heyns产物经持续的氧化、脱水和裂解反应，转化为高活性α-二羰基中间体，如甲基乙二醛(methylglyoxal, MGO)、乙二醛(glyoxal, GO)和3-脱氧葡萄糖醛酮(3-deoxyglucosone, 3-DG)。这些强亲电性的中间体与蛋白质快速发生二次加成和交联，最终形成结构复杂且高度异质的晚期糖基化终末产物(AGEs)。
4.2.2 中枢神经系统中主要的AGEs
AGEs并非单一分子，而是一类高度异质的化合物集合。在CNS中已鉴定出多种与AD病理密切相关的特异性AGEs。其中，Nε-(羧甲基)赖氨酸(CML)是脑组织中含量最丰富、研究最深入的非荧光AGEs。戊糖苷素(pentosidine)和吡咯素(pyrraline)等交联型AGEs则广泛存在于AD患者的老年斑和神经原纤维缠结中。AGE介导的共价修饰和交联不仅直接诱导底物蛋白(如tau和Aβ)的构象固定，使其对蛋白水解降解产生高度抵抗，还显著促进蛋白质错误折叠和异常聚集。
4.2.3 RAGE的结构特征和配体识别
AGEs的病理毒性不仅源于对蛋白质的直接结构损伤，还通过受体介导的胞内信号转导实现。晚期糖基化终末产物受体(RAGE)属于免疫球蛋白超家族的单次跨膜受体。其胞外区域包含一个V型结构域和两个C型结构域(C1和C2)，V型结构域的正电荷表面是识别和结合AGEs的核心区域。值得注意的是，RAGE不仅结合AGEs，还能识别AD病理微环境中存在的其他损伤相关分子模式(DAMPs)，包括寡聚Aβ分子。这种多配体识别特性使RAGE成为AD发病机制中的关键"信号放大器"。
4.2.4 下游信号通路和病理正反馈循环
AGEs或Aβ与胶质细胞和神经元表面的RAGE结合后，受体胞内结构域通过衔接蛋白(如mDia1)传递信号，启动复杂的激酶级联反应，包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路(如p38、ERK1/2)和PI3K/Akt通路。这些激酶级联最终激活IκB激酶(IKK)复合物，介导NF-κB抑制剂IκBα的磷酸化和泛素依赖性降解，从而释放NF-κB。MAPK通路进一步磷酸化NF-κB的p65亚基，增强其转录活性并促进其核转位和靶基因转录。在细胞核内，NF-κB上调多种促炎细胞因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)和NADPH氧化酶(NOX)亚基的转录表达。此外，RAGE激活可通过Rac1等小GTP酶直接招募并激活NOX复合物，快速诱导大量ROS产生。更重要的是，NF-κB激活可反向促进RAGE在靶细胞膜上的表达，从而建立AGEs-RAGE-氧化应激-炎症正反馈循环。
5 AD病理中的糖基化和糖化
5.1 tau蛋白的糖修饰调控
5.1.1 O-GlcNAc修饰与tau磷酸化的相互关系
tau的生理功能高度依赖其翻译后修饰状态的动态平衡。tau富含Ser/Thr残基，这些位点是GSK-3β和CDK5等激酶以及OGT酶的共同靶点。在健康脑中，生理水平的O-GlcNAc修饰通过位点占据和构象稳定化抑制tau的异常过度磷酸化，维持tau的微管结合亲和力。然而在AD脑中，脑葡萄糖代谢减退和氧化应激损害己糖胺生物合成途径(hexosamine biosynthetic pathway, HBP)的通量，伴随OGT活性降低和OGA活性升高，最终导致tau O-GlcNAc修饰水平显著降低。一旦该平衡被破坏，原本受保护的Ser/Thr位点暴露，导致不受控的tau磷酸化、tau从微管解离以及随后的病理性聚集。
5.1.2 N-糖基化对tau聚集的影响
尽管tau经典地被定义为胞质微管相关蛋白，其序列中包含N-糖基化的保守共有序列。已在AD脑提取的成对螺旋丝(PHFs)中检测到tau的异常N-糖基化。然而，由于tau主要定位于胞质而在生理条件下无法接触位于ER和高尔基腔内的N-糖基化酶系，其N-糖基化的确切机制仍不完全清楚。有假说认为病理条件下胞质tau可能被异常转位至ER/高尔基腔室，但目前缺乏直接证据。此外，现有tau N-糖基化证据多依赖凝集素检测和糖苷酶敏感性实验，其特异性在复杂脑裂解液中存在固有局限性，且多数研究未提供位点解析数据。因此tau N-糖基化究竟是一种真实存在的病理性修饰还是部分反映了方法学混杂因素，仍是一个有待解决的问题。异常获得的N-聚糖可显著改变tau的局部电荷、疏水性和空间构象，干扰微管结合，驱动tau单体向促聚集构象转变，并与过度磷酸化协同加速NFTs形成及tau的朊病毒样传播。
5.1.3 AGE修饰的tau：促进聚集和毒性
AD脑中持续的氧化应激微环境导致胞内活性二羰基化合物积累，引发tau的广泛糖化。AGE介导的共价交联"冻结"tau的病理性构象并阻碍其泛素化，使tau对泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体途径的降解高度抵抗。此外，糖化tau可作为损伤相关分子模式(DAMP)，与神经元和胶质细胞表面的RAGE结合，激活胞内氧化应激级联和促炎信号通路，加重细胞骨架崩解和神经元凋亡。
5.2 糖修饰对Aβ代谢的调控
5.2.1 APP的N-/O-糖基化和分泌酶切割
APP是一种典型的跨膜糖蛋白，其N-和O-糖基化在调节其亚细胞定位、蛋白质折叠和酶切通路选择中发挥关键作用。APP胞外结构域的N-糖基化对其正确折叠和囊泡运输必不可少。更为重要的是，APP上的O-糖基化位点集中在β-分泌酶1(BACE1)切割位点的侧翼区域，该修饰可通过空间位阻直接阻碍BACE1与APP底物的结合，从而抑制淀粉样蛋白生成途径。AD脑中APP糖基化模式的异常，如高甘露糖型聚糖增加和复杂型聚糖减少，导致APP在核内体的酸性环境中异常滞留，显著增加其被BACE1切割的概率。
5.2.2 BACE1和γ-分泌酶的糖基化和酶活性
BACE1具有四个保守的N-糖基化位点，这些位点的修饰对维持蛋白质稳定性、正确折叠和水解活性不可或缺。γ-分泌酶复合物的关键亚基尼卡斯特林(Nicastrin, NCT)的功能高度依赖N-糖基化，NCT必须经历从高甘露糖型到复杂型聚糖的逐步成熟过程才能与PS1、APH-1和PEN-2亚基正确组装成功能性四聚体复合物。因此，抑制这些关键分泌酶的异常糖基化加工已成为减少Aβ产生的潜在治疗策略。
5.2.3 AGE修饰的Aβ：增强聚集和神经毒性
Aβ肽的糖化不仅发生在细胞外沉积阶段，也可在胞内生成过程中发生。AGE修饰的Aβ相较于天然Aβ单体表现出显著增强的聚集倾向。糖化Aβ优先与胶质细胞表面的RAGE结合而非介导吞噬清除的清道夫受体，使其更难被小胶质细胞降解。AGE-Aβ通过激活氧化应激和促炎信号通路，诱导更强烈的突触丢失、神经元功能障碍和凋亡。
5.3 神经炎症中的糖修饰
5.3.1 小胶质细胞的糖基化变化
小胶质细胞表面受体TREM2和CD33等是高度糖基化的跨膜蛋白。在AD进展过程中，小胶质细胞的N-糖基化发生显著且异质性的重塑。需要指出的是，单细胞和单核转录组研究已揭示AD中小胶质细胞存在多种疾病相关状态而非简单的M1/M2极化二分法，包括疾病相关小胶质细胞(DAM)等亚群。CD33功能异常的根本原因在于其异常糖基化损害了小胶质细胞对Aβ的吞噬清除。相反，TREM2的N-糖基化是维持其细胞表面稳定表达和Aβ吞噬能力的前提。AD相关小胶质细胞的异常糖基化往往导致病理性识别和清除功能受损，使细胞锁定在持续释放促炎因子的慢性激活状态。
5.3.2 AGEs-RAGE通路与NF-κB介导的神经炎症
AD脑细胞外间隙中AGEs的持续积累为慢性神经炎症提供了持续的激活信号。AGEs与胶质细胞表面RAGE结合后，激活MAPK和PI3K/Akt激酶级联，随后触发IKK复合物，介导IκBα的磷酸化和降解，释放NF-κB入核并启动靶基因转录。该机制不仅显著上调IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎细胞因子的转录和释放，还通过NF-κB与RAGE启动子的结合促进RAGE自身的过表达，形成正反馈循环。
5.4 酶促糖基化与非酶促糖化的交叉对话
5.4.1 基于共同代谢底物的竞争
脑葡萄糖代谢损伤是AD最早的病理标志之一。生理条件下约2%-5%的胞内葡萄糖进入HBP生成UDP-GlcNAc。然而在AD脑中，葡萄糖摄取显著下降和氧化应激对HBP限速酶GFAT的抑制共同导致HBP通量收缩，UDP-GlcNAc供应不足，引起保护性酶促糖基化全面降低。同时，持续的氧化应激和糖酵解功能障碍诱导MGO等活性二羰基化合物异常积累，自发触发美拉德反应导致AGEs大量形成。这种基于共同前体的病理性代谢分流表现为AD脑中的失衡：生理保护性糖基化受抑与病理损伤性糖化增殖并存。
5.4.2 病理底物上的竞争与协同
以tau为例，两种糖修饰在分子水平上发挥序贯协同效应。首先O-GlcNAc修饰靶向tau的Ser/Thr残基，竞争性抑制激酶对这些位点的磷酸化。随着AD脑中O-GlcNAc水平下降，暴露的位点发生异常磷酸化，触发tau从微管解离和构象崩塌。随后构象异常的tau暴露其Lys和Arg残基，并被活性二羰基化合物攻击。最终AGEs通过不可逆共价交联将tau锁定在病理性构象，形成不溶性NFTs。类似地，Aβ的生成和病理毒性也受到两种修饰的协同调控，构成同一底物上的序贯"多重打击"机制。
5.4.3 神经炎症通路的汇聚
小胶质细胞免疫受体(TREM2、CD33)的异常N-糖基化损伤其Aβ识别和清除能力，导致Aβ和AGEs持续积累。积累的AGEs与胶质细胞RAGE结合，激活NF-κB介导的促炎信号通路。炎症微环境中产生的ROS不仅加速非酶促糖化，还抑制OGT催化活性，加剧O-GlcNAc水平下降和酶促糖基化异常。该过程形成完整的病理正反馈循环：酶促糖基化受损→病理性识别和清除障碍→Aβ/AGEs积累→RAGE-NF-κB炎症通路激活→氧化应激加剧→AGEs生成增加和酶促糖基化恶化。
6 诊断和治疗潜力
6.1 糖基化相关生物标志物
在CSF和外周血中，AD患者表现出特征性的N-糖基化模式异常。CSF中APP、ApoE和转铁蛋白等蛋白的末端唾液酸化减少和平分型GlcNAc水平异常与脑内Aβ病理负荷、tau磷酸化水平和认知评分显著相关。外周血中免疫球蛋白G(IgG)的N-糖基化谱改变也被证实与AD风险和认知衰退速度相关。作为非酶促糖化的关键产物，CML和戊糖苷素等特征性AGE分子在血清和CSF中的异常升高可间接反映CNS的氧化应激和糖化负荷，并与AD Braak病理分期和认知衰退严重程度显著相关。皮肤自发荧光检测作为一种反映全身AGE积累的非侵入性替代标志物，已被多项观察性研究证实与AD患者认知衰退显著负相关。
6.2 治疗策略
6.2.1 增强保护性糖基化
通过药理学方法整体提高脑内O-GlcNAc修饰水平是目前最有前景的治疗策略之一。由于直接激活OGT易产生严重的脱靶毒性，当前研发重点集中在OGA抑制剂上。临床前研究一致表明，升高脑内O-GlcNAc可减少tau过度磷酸化、改善神经原纤维病理并提高小鼠认知表现。然而需要明确区分靶点占据与临床疾病修饰效果。礼来公司开发的ceperognastat在早期症状性AD的II期试验中未达到主要疗效终点，其开发已被终止。该结果提供了重要警示：确证的临床前疗效和靶点占据并不一定转化为临床获益。目前Asceneuron的OGA抑制剂(如ASN51)正在开展I/II期研究。除直接靶向OGA外，改善脑葡萄糖代谢和上调HBP通量以增加UDP-GlcNAc供应等间接策略同样重要。
6.2.2 阻断损伤性糖化级联
针对非酶促糖化及其下游通路的干预主要分为三个层面：抑制AGEs形成、断裂已有AGEs交联以及阻断AGE-RAGE下游病理信号。羰基清除剂如氨基胍和吡哆胺可中和活性二羰基中间体，但均因严重不良反应或未达临床终点而失败。交联断裂剂Alagebrium在AD中缺乏充分的临床证据。靶向RAGE的小分子拮抗剂Azeliragon在II期试验中显示认知保护趋势，但在III期试验中未达到轻中度AD患者的认知改善主要终点。尽管如此，通过优化临床试验设计和实施精确病理分层，RAGE靶向治疗仍是AD神经炎症干预的重要研究方向。
6.3 未解决问题和未来方向
当前大多数研究孤立地关注单一类型的修饰，缺乏对AD脑内酶促糖基化和糖化动态交叉对话的时空异质性进行系统表征。未来应开发更高特异性的正电子发射断层扫描(PET)示踪剂以实时无创监测AGEs积累和OGA活性。系统性地改变糖基化网络不可避免地引入脱靶效应和缩窄安全窗口，OGA抑制剂长期使用是否干扰外周正常生理过程需要更严格的长期毒理学评估。目前糖蛋白组学技术对体液中低丰度糖基化修饰的检测灵敏度仍有限，外周血糖修饰变化与中枢病理改变的相关性和特异性需要大规模多中心临床队列验证。鉴于AD发病机制的复杂性，未来治疗范式可能需要转向组合靶向策略方向，例如在精准医学分层指导下，将OGA抑制剂与RAGE拮抗剂或AGEs抑制剂联用，以协同重塑中枢葡萄糖代谢和修饰网络。
7 结论与展望
本综述在AD脑葡萄糖代谢减退的统一框架下整合了酶促糖基化和非酶促糖化，强调了两者对tau病理、APP/Aβ加工和神经炎症的汇聚性影响。已确认的发现包括：AD脑中O-GlcNAc修饰整体降低并与tau磷酸化相互调控；AD脑和CSF中AGEs积累升高；RAGE信号介导AGEs和Aβ诱导的神经炎症反应；脑葡萄糖代谢减退是AD的早期特征；AD患者样本中可检测到N-聚糖谱改变。推测性或需进一步验证的领域包括：tau N-糖基化的确切机制和位点特异性；糖化/糖基化改变与AD发病之间因果关系方向；外周聚糖和AGEs生物标志物的AD特异性；OGA抑制的临床可转化性；以及OGA-RAGE联合或多靶点抗糖化策略的治疗潜力。未来研究应优先推进位点特异性糖蛋白组学、独立重复的纵向生物标志物研究、对失败临床试验的再分析以识别最可能获益的患者亚组，以及将糖生物学与单细胞转录组学整合以定义疾病相关小胶质细胞状态。总体而言，采取谨慎而机制知情的方法对于将糖生物学见解转化为有效的AD疾病修饰疗法至关重要。
