内含子结构变异GhEBS1通过调控染色质可及性与基因表达驱动棉花果实大小分化

《Plant Biotechnology Journal》：An Intronic Structural Variant in GhEBS1 Drives Cotton Fruit Size Divergence by Modulating Chromatin Accessibility and Gene Expression

果实大小不仅是植物进化中的重要适合度性状，也是作物驯化与改良中的重要农艺目标，然而其调控机制仍鲜有表征。本研究通过图位克隆鉴定了一个F-box E3泛素连接酶基因GhEBS1（ENLARGED BOLL SIZE 1），作为棉花铃大小的正调控因子。位于GhEBS1启动子近端内含子区域的一个845-bp结构变异（structural variant, SV）改变了局部染色质可及性和组蛋白修饰，特别是H3K27与H3K9的甲基化水平和乙酰化状态，从而调控GhEBS1表达并驱动棉铃大小分化。在棉花（蒴果）、番茄（浆果）和拟南芥（角果）中过表达或异源表达GhEBS1均促进果实增大，表明其功能具有保守性。进一步分析显示，GhEBS1与GhPPD1/2及GhKIX8/9互作，调控下游细胞增殖相关基因，进而控制细胞数目与铃大小。育种评估证实，优良等位基因GhEBS1^L可显著增加铃大小、种子大小和铃重。单倍型分析揭示GhEBS1^L起源于陆地棉（Gossypium hirsutum）race latifolium，并在棉花驯化过程中经历了人工选择。本研究结果为植物果实大小调控提供了新见解，并为作物产量改良提供了有价值的遗传位点。

**一、研究背景与科学问题**

果实大小是植物进化适合度的关键性状，同时也是作物驯化与遗传改良中最重要的农艺目标之一。果实最终尺寸主要由细胞增殖与细胞扩张两个发育过程协同决定，其中细胞增殖是器官生长的基本驱动力。棉花铃属于蒴果型果实，由铃壳（果皮）、种子和纤维三部分构成，铃大小是棉花产量的核心构成要素，也是田间育种的首要选择目标。尽管已有众多调控果实/种子大小的基因被鉴定，如番茄的fw2.2、水稻的GS3和GW2等，但棉花铃大小的遗传调控机制仍不清楚。前人研究表明，SCF（SKP1/CULLIN1/F-box）复合体依赖的泛素-蛋白酶体途径是植物器官大小调控的核心级联通路，其中F-box蛋白作为底物招募型E3泛素连接酶发挥关键作用。拟南芥中的同源基因AtSAP通过靶向PEAPOD（PPD）和KIX蛋白进行泛素化降解，正调控叶片和果实大小。然而，棉花中控制铃大小的基因及其调控机制尚未阐明。此外，非编码区（如启动子和内含子）的表观遗传修饰在基因表达调控中发挥重要作用，内含子结构变异通过改变局部表观状态调控农艺性状的案例已有报道，但内含子结构变异调控基因表达进而改变植物表型的具体机制仍亟待探索。研究人员此前开发了A07染色体置换系SL7，表现为铃增大表型。基于此，本研究旨在克隆控制棉铃大小的关键基因并阐明其调控机制。

**二、研究内容与主要技术方法**

研究人员以LMY22与SL7为亲本构建F₂、F_2:3、F_2:4和F_2:5群体进行图位克隆，结合重测序开发的InDel和SNP标记将QTL精细定位至187.9-kb区间。利用转录组分析筛选候选基因，通过459份陆地棉自然群体的关联分析验证候选基因与表型的关联。采用农杆菌介导的遗传转化获得棉花过表达和CRISPR/Cas9敲除株系，并在拟南芥和番茄中进行异源表达验证。主要技术方法包括：ATAC-seq（转座酶可及染色质测序）分析全基因组染色质可及性、ChIP-qPCR（染色质免疫沉淀-定量PCR）检测组蛋白修饰、双荧光素酶报告系统（dual-LUC）验证转录调控、酵母双杂交（Y2H）和荧光素酶互补成像（LCI）验证蛋白互作、单倍型与核苷酸多样性分析追踪等位基因起源，以及4代回交结合标记辅助选择（MAS）进行育种潜力评价。

**三、主要研究结果**

**3.1 铃大小因果基因的鉴定**：通过连续多世代重组体筛选，将控制铃大小的QTL定位至A07染色体187.9-kb区间，区间内注释到3个基因。转录组分析显示仅编码E3泛素连接酶的GH_A07G2179在亲本间差异表达，且在5天开花后（DPA）铃壳中优势表达。该基因被命名为GhEBS1。在459份陆地棉自然群体中，缺失845-bp片段的基因型表现出显著更大的铃长、铃宽和铃重，GWAS分析进一步确认该SV与种子大小显著关联。

**3.2 GhEBS1的保守功能验证**：在棉花中过表达GhEBS1显著增加铃大小、种子大小和铃重，而CRISPR/Cas9敲除株系则表现出铃大小、铃重和种子指数显著降低，同时叶片、苞叶和花朵变小。异源表达实验表明，GhEBS1在拟南芥中导致莲座叶呈穹顶状、角果短宽扁平化，并完全互补拟南芥sod3突变体表型；在番茄中显著增大果实并提高单果重。这些结果证明GhEBS1是植物果实大小的保守正调控因子。

**3.3 SV845bp通过调控GhEBS1表达驱动铃大小分化**：瞬时LUC实验表明，含845-bp插入片段的构建体荧光活性显著低于缺失构建体。在拟南芥中，gGhEBS1^L转基因株系的GhEBS1表达水平显著高于gGhEBS1^S。在棉花自然群体中，GhEBS1^L基因型材料表现出更高GhEBS1表达并与铃大小正相关，证明SV845bp是控制GhEBS1表达的因果变异。

**3.4 SV845bp通过改变染色质可及性和组蛋白修饰调控GhEBS1表达**：ATAC-seq分析鉴定出21,120个亲本间差异可及区（DARs），其中显著的DAR与845-bp结构变异区域重叠。DNA pull-down结合质谱鉴定发现SAP18（组蛋白去乙酰化酶复合体亚基）可富集于该序列。ChIP-qPCR结果显示，GhEBS1^L基因型中抑制性标记H3K27me3和H3K9me2的富集水平显著降低，而活性标记H3K27ac和H3K9ac的水平显著升高，且信号在SV上游141-bp处达到峰值。

**3.5 GhEBS1通过调控细胞增殖控制果实大小**：扫描电镜观察显示，GhEBS1敲除株系铃表皮单位面积细胞数显著减少，大铃亲本SL7的铃表皮细胞数多于小铃亲本LMY22。叶片解剖分析同样表明过表达株系细胞数增加而敲除株系细胞数减少，证明GhEBS1通过调控细胞增殖而非细胞扩张来控制器官大小。

**3.6 GhEBS1与GhPPD1/2和GhKIX8/9互作调控下游细胞增殖基因**：Y2H和LCI实验证实GhEBS1与GhPPD1、GhPPD2、GhKIX8和GhKIX9直接互作。转录组分析显示大铃亲本SL7中细胞增殖相关基因（GIF3、GRF2/4、CYCs、CDKs、CDCs）显著上调，而敲除株系中GRF1/3/5、CYCDs、CYCBs及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因（KRP4、SMR3）显著下调。双荧光素酶实验证明GhPPD2抑制GhCDT1A、GhCYC3;4、GhCYCD1;1和GhCYCD3;2启动子活性，而GhEBS1共表达可缓解这种抑制作用。

**3.7 GhEBS1^L的起源与人工选择**：2,578份改良陆地棉中15.3%携带GhEBS1^L（845-bp缺失）。该缺失在7个陆地棉族（race）中主要存在于latifolium（47.1%），并完全缺失于最原始的野生族yucatanense。单倍型分析鉴定出3种缺失型单倍型，其中98.1%的改良品种携带latifolium优势单倍型Hap6。系谱分析追溯至Acala、Delfos和Trice等早期美国品种。核苷酸多样性分析显示GhEBS1^L品种中该位点多样性显著降低，证实其经历人工选择。

**3.8 GhEBS1^L的育种应用潜力**：通过4代回交将GhEBS1^L导入10个陆地棉品种，2年田间试验显示所有遗传背景下铃长（9.25%–18.81%）、铃宽（7.26%–16.82%）、铃重（9.85%–23.44%）和种子指数（11.94%–22.86%）均显著提高。衣分在多数杂交组合中无显著变化。籽棉产量在小铃亲本（铃重≤5.54 g）背景下显著增加17.2%–24.64%，但在大铃亲本（铃重≥5.67 g）背景下显著下降11.28%–24.07%，这种产量权衡可能归因于铃重与铃数之间的负相关。

**四、讨论与结论**

本研究通过图位克隆鉴定了一个控制棉铃大小的F-box E3泛素连接酶基因GhEBS1，揭示了启动子近端内含子中845-bp结构变异通过改变染色质可及性和组蛋白修饰来调控基因表达的分子机制。该机制与已知的内含子变异调控作物性状的案例（如小麦TaVRT和TaOGT1）共同确立了内含子结构变异作为作物改良关键调控因子的重要性。研究还从进化视角阐明了GhEBS1^L等位基因起源于陆地棉race latifolium，并在机械采收替代人工采收的育种历史背景下经历了人工选择的命运转变。研究者提出的模型为：845-bp缺失改变染色质可及性，降低H3K27和H3K9甲基化水平同时提高乙酰化水平，上调GhEBS1表达；升高的GhEBS1蛋白促进GhPPD1/2-GhKIX8/9抑制复合物的泛素化降解，解除对细胞增殖基因的转录抑制，最终增加细胞数目和铃大小（图6h）。研究结论指出，GhEBS1^L可显著增加棉花铃大小、种子大小和铃重，但仅在铃重≤5.54 g的小铃品种中提高籽棉和皮棉产量，在铃重≥5.67 g的大铃品种中应避免应用。该基因在双子叶植物中的功能保守性进一步提示其作为作物果实和种子大小改良通用靶点的潜力，为棉花高产分子育种提供了新的遗传位点和理论指导。