阳极电位重定向野生型蓝细菌光电流以增强光（生物）电化学系统产氢

《Sustainable Chemistry for the Environment》：Rewiring Cyanobacterial Photocurrent to Enhance Hydrogen Production in Photo(bio)electrochemical Systems

　　

产氧光合作用中的光合蓝细菌能够产生胞外光电流，为生物电和燃料生产提供可持续路径。然而，胞内电子循环和低效的胞外电子传递常限制光电流。先前的生物光电电解系统需要外源介体或物理/遗传细胞修饰以实现析氢。在此，研究人员证实了野生型 Synechocystis sp. PCC 6803 无介体光电流直接产氢，并评估了相关代谢代价。研究人员研究了施加阳极电位如何在双室光（生物）电化学系统（photo(bio)electrochemical system，PES）中增强光电流和产氢。施加 1.0 V（vs. Ag/AgCl）阳极电位导致光电流密度高达 2.1 ± 0.09 mA cm^?2，在测试操作条件下能够以 0.154 ± 0.006 m³ m^?2 d^?1 的速率进行生物制氢，法拉第效率（Faradaic efficiency，FE）为 90 ± 4%。在 24 h 内，该系统通过累积电荷 441 C，并释放 48.5 ± 2.1 mL 氢气；当省略悬浮细胞时，分别为 109 C 和 11.5 ± 0.7 mL，而无细胞存在时为 12 C。电化学分析显示，在重复操作周期中氧化还原活性增强，电子传递动力学改善，表明强生物膜–电极相互作用。施加的电压增强微生物代谢，增加 ATP（adenosine triphosphate，腺苷三磷酸）产生和单细胞蛋白质生产率。然而，该研究仅限于 24 h 批式操作，光电流在约 2 h 后下降；长期稳定性和放大仍有待证明。这些发现表明，受控电化学偏压能有效将光合电子重定向至电化学输出，用于可持续制氢和生物基制造。

研究背景与问题：电微生物学在生物炼制中兴起，生物电化学系统可产生可持续电流、生化品和燃料及环境修复，但中试规模应用未完全实现。主因是依赖胞外电子交换能力有限的微生物。研究人员关注高效产电微生物如 Shewanella 和 Geobacter spp.、遗传修饰微生物或混合菌群，但仍存在严格生长条件（主要为厌氧）和致病性等挑战。生物光伏（biophotovoltaic，BPV）概念使用光合自养微生物如蓝细菌、藻类和高等植物，有望解决传统暗电微生物学的许多挑战。Pisciotta 等首次报道利用野生蓝细菌在光合微生物燃料电池中产电 1.3 mW/m²。随后其他研究报道蓝细菌的光驱动产电活性。例如 Bombelli 等（2011）分析微生物密度、介体和光强等因素限制 PCC 6803 在 BPV 系统中将太阳能转化为电流。Sawa 等展示使用喷墨打印纸基微生物燃料电池从 Synechocystis sp. PCC 6803 收集电力，可为可穿戴传感器供电。尽管光合 MFC 已证明能量以电力回收，但回收功率太低，除低占空比传感器外难以实际应用。因此需要将光电流转化为可存储、更高价值的能量载体。将蓝细菌光电流转化为可存储燃料的尝试始于十多年前。McCormick 等证明 Synechocystis sp. PCC 6803 在双室生物光电电解池中通过产氧光合作用产氢，确立光合电子可驱动阴极析氢而不抑制产氧；但该系统依赖外源介体铁氰化钾，电流密度为 μA cm^?2 范围。后续生物光电化学电池仅在温和物理破碎细胞或与无机光阳极耦合后才实现无介体析氢，且仍比本文报道的光电流低两到三个数量级。更广泛的生物光伏系统调查得出相同结论：提取效率而非光合电子供应是限制步骤。本工作与这些系统三点不同：第一，氢由野生型、未修饰、无介体 Synechocystis 产生，无需牺牲供体、氧化还原穿梭或细胞破碎步骤；第二，正阳极偏压有意用作与胞内电子循环竞争的电子汇，而不仅是将电极固定在一定电位；第三，电化学输出与其对细胞的生理后果一起报告，测量色素含量、生物量、蛋白质产量和 ATP 水平，据研究人员所知此前未在蓝细菌光电电解系统中量化。这些共同给出无介体光电流 2.75 mA cm^?2 和产氢速率 0.154 m³ m^?2 d^?1，据研究人员所知均为未修饰蓝细菌迄今报道的最高值。尽管明确知道限制电活性光合微生物生长和发育的因素，当前产生仅报道在微水平。该电流产生限制可能由于从光激发光合系统 I（photosystem I，PSI）和 PSII 提取电子效率低，因为反应中心通常位于细胞膜内至少 4 nm。因此，光激发后立即从 PSI 和 PSII 提取电子将带来高热力学增益。然而，仍缺乏能从 PSs 提取电子的工具包。近期研究提出通过氧化外周叶绿素色素介导电子传递，在初始光激发期间离域电荷转移。这意味着外部氧化应激可促进重布线，便于光激发后立即从光合系统提取电荷。施加到阳极的正电压产生显著电动势（electromotive force，EMF），吸引周围环境电子，包括细菌来源电子。该 EMF 使直接从细菌 PSI 和 PSII 提取电子成为可能，从而满足阳极电子需求。此外，确认收获电子能促进次级有益反应至关重要。例如，这些电子可通过水分解产氢或将二氧化碳（CO₂）还原为有价值产物。强调这些能力将突出电子提取有效性，并揭示可持续能源生产和碳捕获潜力。因此，本研究旨在探索在光和暗条件下使用施加阳极电位从 Synechocystis sp. PCC 6803 提取电子。四个具体目标：(i) 确定在 0–1.0 V（vs. Ag/AgCl）范围内光和暗条件下最大化光电流回收的阳极电位；(ii) 量化从该光电流在阴极产生的生物氢及相关法拉第和能量效率；(iii) 建立施加偏压如何影响细胞生理，测量色素含量、生物量、蛋白质产量和 ATP 水平；(iv) 提出与伏安、计时电流和显微证据一致的电子传递路线。研究人员首次测试光微生物电解直接利用微生物在双室 PES 中使用阴离子交换膜（anion exchange membrane，AEM）产生的光电流高产纯生物氢。在最佳应激下通过测量总蛋白和分泌蛋白、ATP 水平、叶绿素浓度和电流输出评估微生物代谢响应。此外，评估使用 PCC6803 获得电流的 PES 产氢潜力，以评价系统能源生产可行性。

技术方法概括：研究人员使用野生型 Synechocystis sp. PCC 6803，在 BG-11 中培养至晚期指数期（OD₆₈₀ = 2.5），离心洗涤后重悬于新鲜 BG-11。构建双室玻璃 PES，阳极和阴极工作体积 50 mL，以 AEM 隔开，石墨棒为电极，Ag/AgCl 为参比，恒电位仪控制阳极电位，白光 LED 照明，暗实验用黑箱。进行了极化、Tafel、循环伏安（cyclic voltammetry，CV）和计时电流分析；监测 OD₆₈₀、UV-Vis、总/可溶性蛋白和 ATP。阴极氢气用液体置换法收集，气相色谱（gas chromatography，GC）定量，计算法拉第效率（FE）和能量效率（EE）。所有实验三个独立生物重复。样本来源为野生型 Synechocystis sp. PCC 6803 的实验室 stock culture。

3.1 电流响应：通过极化和计时电流研究 PES 产电。对照 BG-11 无显著电流；蓝细菌光照下电流随电压升高。1.0 V 下最高平均光电流密度 2.1 ± 0.09 mA cm^?2；暗下最大 0.74 ± 0.04 mA cm^?2。PES-1/Syn-Bio 呈钟形，最大 2.75 ± 0.82 mA cm^?2；PES-1/Bio 最大 0.98 ± 0.05 mA cm^?2；PES-abiotic 几乎无电流。24 h 累积电荷 PES-1/Syn-Bio 441 C，PES-1/Bio 109 C，PES-abiotic 12 C。表明悬浮细胞贡献大部分可回收电荷。

3.1.1 极化和循环伏安：极化显示第一天开路电压 0.81 V，内阻 2.5 Ω cm²，最大可持续电流密度 0.43 mA cm^?2，最大功率 0.045 mW/cm²。五个批式周期后功率 0.21 mW/cm²，电流密度 0.95 mA/cm²，峰电压 0.86 V，内阻降至 1.55 Ω cm²。Tafel 斜率从 0.97 降至 0.71 V dec^?1，交换电流密度从 0.024 升至 0.029 mA cm^?2，归因于生物膜成熟降低界面和传输阻力，而非机制改变。CV 显示 BG-11 背景小；第一周期出现氧化还原电流，第五周期法电流更高，dI/dV 显示更多离散氧化还原对可寻址，峰位移动小于约 0.1 V，表明电活性中心群增大。

3.1.2 不同条件下的计时电流：对照无显著电流；光照下 1.0 V 光电流最高。暗下电流下降。PES-1/Syn-Bio 24 h 电流衰减，最大 2.75 mA cm^?2，累积 441 C；PES-1/Bio 0.98 mA cm^?2，109 C；PES-abiotic 12 C。表明光驱动电子传递和悬浮细胞贡献。

3.2 细菌代谢和副产物生成：UV-Vis 峰 450、637、688 nm 对应叶绿素 a、藻蓝蛋白、叶绿素 a Q_y。PES-1/Syn-Bio 色素峰位置不变，叶绿素 82 mg/L、藻蓝蛋白 10.3 mg/L，与 PES-0/Syn-Bio（79、10.2 mg/L）和 C/Syn（79、10.1 mg/L）相比仅小趋势。生物量和蛋白质产率 PES-1/Syn-Bio 为 3.9 ± 0.2 和 1.49 ± 0.17 mg L^?1 h^?1，细胞蛋白同化 34 ± 1.7%（干重）。ATP 0.188 ± 0.006 mmol，高于 PES-0 0.155 ± 0.006 mmol 和 C/Syn 0.15 ± 0.005 mmol；ATP 产率 0.89、0.773、0.8 mmol/gdw，高于维持关键代谢功能基线 0.27 mmol/gdw。氢气产量 PES-1/Syn-Bio 48.5 ± 2.1 mL d^?1，产率 0.154 ± 0.006 m³ m^?2 d^?1，纯度 >99%；PES-1/Bio 11.5 ± 0.7 mL/d，0.036 ± 0.0021 m³/m².d。FE 90±4% 和 85 ± 5%。能量效率约 140% 仅电输入，不包括太阳能。氢气钟形曲线约 6 h 峰值。表明施加电压增强代谢，但色素变化小，电流来自电子重路由。

3.3 在施加电位下光电流产生的推测机制：提出阳极电位下 Synechocystis 通过复杂生化过程促进胞外电子传递（extracellular electron transfer，EET）。光吸收 PSII 催化水氧化，产生电子、质子和氧；电子从 P680 到 P680^*，经质体醌（plastoquinone，Pq）和细胞色素 b₆f 复合体（Cytb6f），Cytb6f 可能还原未知介体。电子到 PSI，P700 到 P700^*，释放至铁氧还蛋白（ferredoxin，Fd），再到 Fd-NADP⁺还原酶产生 NADPH；NADPH 为 Calvin-Benson 循环能量载体。施加阳极电位下，未知介体 M 通过多路线促进电子传递。从 PSII 收集电子可能热力学有利，但需合适电压打破电阻屏障；电子也可从 Fd 和 NADPH 通过外电子穿梭如细胞壁结合蛋白或分泌黄素收集。该机制可能绕过传统生物合成，使电子流向阳极。FESEM 显示操作后阳极有密集细胞层与石墨紧密接触，支持直接电子传递，与 PES-1/Bio 残余电流 0.98 ± 0.05 mA cm^?2一致。

3.4 优势、局限和风险：优势：使用野生型未修饰蓝细菌，无外源介体、牺牲供体或细胞破碎；电化学表征结合极化、Tafel、伏安和导数分析；实验分离浮游和生物膜贡献，有非生物对照；报告电化学输出及生理成本。局限：24 h 批式，光电流约 2 h 后衰减；单光照、单培养基、单几何；三个生物重复；裸石墨阴极；能量效率仅电输入；介体未分离鉴定；文献比较受电极归一化和光照影响。风险：PCC 6803 非致病，但阳极产氧和阴极产氢共存，放大或损坏时可能产生可燃混合物，需气密分离、监测和通风；正电位可能选择变异；高表观效率可能被误读。

讨论部分总结：研究结果表明，在 Synechocystis 基 PES 中施加电压应激增强光电流生产，提供克服蓝细菌电子提取固有局限的可行策略；通过施加外部电压优化 PS I 和 II 电子传递，增加光电流密度，并用于阴极产氢，具有高 FE 和 EE，表明施加电压是增强 PES 产氢的重要参数。意义超出能源生产，包括环境修复和通过 CO₂ 还原的绿色化学品生产；Synechocystis PCC 6803 是光合生物炼制有价值生物。电压应激下微生物生长、蛋白质生产和 ATP 合成改善可增强各种生物产品产量。未来研究应检查长期电压应激影响，理解电子传递和代谢活性改善的分子机制，开发降低过电位损失和增强电子收集效率的新材料和电极配置，扩展到其他光合微生物并整合到复杂生物炼制系统，整合碳捕获，利用基因工程进一步增强电子传递效率，进行中试和现场应用，关注长期运行稳定性、连续模式、生物膜耐久性和昼夜光周期下的性能。

研究结论翻译：本研究证明了一种简单有效的路线，在施加电压应激下增强 Synechocystis 光电流生产，解决了产氧光养生物电子提取低效的长期问题。在施加电位 1.0 V 时，PES 实现了高达 2.75 mA cm^?2 的光电流密度，光照期间平均 2.1 ± 0.09 mA cm^?2，黑暗下为 0.74 ± 0.04 mA cm^?2，并在 24 h 内通过 441 C。该光电流支持以 0.154 ± 0.006 m³ m^?2 d^?1（48.5 ± 2.1 mL d^?1）产氢，法拉第效率 90 ± 4%，纯度高于 99%，对应仅电输入的能量效率约 140%。去除悬浮细胞使光电流降至 0.98 ± 0.05 mA cm^?2，产氢降至 0.036 ± 0.002 m³ m^?2 d^?1，表明浮游群体而非仅阳极生物膜提供了大部分可回收电荷。伏安及其一阶导数显示，随着生物膜成熟，更多氧化还原对变得电化学可寻址，峰位移动小于 0.1 V，而 Tafel 斜率 0.97 和 0.71 V dec^?1 表明组合界面和传质控制，而非单一速率决定电子传递。施加电压应激通过刺激代谢活性和增加蛋白质合成增强微生物生长，凸显该技术高效利用光合微生物能量的更广泛适用性。相比之下，色素池仅轻微变化，表明额外电流源于电子重路由，而非光捕获装置扩增。这些发现应结合研究局限解读：24 h 批式窗口、单一光照方案、未修饰石墨阴极、三个生物重复以及光电流约两小时后衰减。该方法为未来开发可扩展生物基光电化学技术以应对各种可持续性挑战提供了基础。