《Bioengineering & Translational Medicine》：Mechanisms and determinants of mRNALipid Nanoparticle biodistribution: From pharmacokinetics to clinical translation
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信使RNA（mRNA）疗法经脂质纳米颗粒（LNPs）制剂化后，通过实现瞬时、可编程的蛋白质表达，革新了核酸药物领域，应用于疫苗接种、蛋白质替代、免疫治疗和基因组工程。将其临床成功拓展至疫苗之外，需要从机制上理解LNP组分和mRNA的体内迁移路径、所进入的细胞类
信使RNA（mRNA）疗法经脂质纳米颗粒（LNPs）制剂化后，通过实现瞬时、可编程的蛋白质表达，革新了核酸药物领域，应用于疫苗接种、蛋白质替代、免疫治疗和基因组工程。将其临床成功拓展至疫苗之外，需要从机制上理解LNP组分和mRNA的体内迁移路径、所进入的细胞类型、货物被翻译的位置以及各组分的清除方式。此类生物分布结果受纳米颗粒理化性质、给药途径、蛋白冠形成、宿主生理状态、细胞内运输和降解之间的复杂相互作用调控。重要的是，脂质组分、完整mRNA、降解的RNA片段以及翻译后的蛋白质的生物分布代表各自独立却又相互关联的生物学过程，不应互换解读。分子成像、定量核酸检测、质谱分析、空间和单细胞技术以及药代动力学建模方面的进展正在提高它们在组织和时间维度上的分辨率。与此同时，合理的脂质工程改造、选择性器官靶向、可电离脂质的可生物降解设计、配体导向递送以及人工智能辅助设计正在拓展肝和淋巴器官以外组织特异性递送的可能性。然而，解释仍受限于检测方法异质性、对蛋白冠动力学和内体逃逸的不完全理解、物种依赖性差异以及缺乏统一的监管标准。本综述审视了调控mRNA-LNP处置的机制，评估了当前分析方法所能检测到的内容及其遗漏之处，综合了临床前和临床证据，并探讨了实现可预测、组织选择性和可临床转化的mRNA递送所需策略。
1 引言
信使RNA（mRNA）疫苗和治疗药物正重塑现代医学，提供应对传染病、遗传性疾病和癌症的机会。该技术的概念基础建立于20世纪90年代，当时注射质粒DNA或mRNA被证明能在体内驱动蛋白质合成，后续研究表明体外转录的mRNA脉冲处理树突状细胞可呈递抗原并激发免疫反应。早期临床成功，特别是COVID-19疫情期间mRNA疫苗的快速开发和部署，加速了mRNA在肿瘤学中的应用，其中mRNA构建体可刺激针对肿瘤相关抗原的免疫反应。同时，研究性mRNA疗法正通过基因补充、蛋白质替代及其他疾病修饰策略推进用于遗传和代谢性疾病。有效的mRNA递送主要依赖于脂质纳米颗粒（LNPs），其保护RNA免受酶降解、促进细胞摄取并协助胞质释放。LNP介导的mRNA递送效率和解剖分布受给药途径、粒径、脂质化学性质和表面组成的强烈影响。尽管取得了显著临床进展，含mRNA和LNPs制剂的药代动力学和生物分布仍未完全阐明。根本性问题涉及这些纳米颗粒如何在体内移动、它们到达哪些组织和细胞群、遇到并相互作用哪些生物分子、脂质组分和mRNA持续多长时间、以及递送的mRNA在哪里产生功能性蛋白质。重要的是，LNP相关脂质、完整mRNA、RNA降解产物和编码蛋白遵循不同但相互关联的空间和时间分布。因此，检测某一组分不能假定表明另一组分的存在或生物活性。这些区别对于理解治疗效果、免疫激活、耐受性和潜在的脱靶效应至关重要。随着mRNA技术从主要单剂量疫苗接种转向全身给药和重复治疗，残留脂质组分、累积暴露和对制剂辅料的免疫反应可能改变清除率和随后的生物分布，这些问题变得尤为重要。生物分布研究因此既为制剂设计提供了机制基础，也是转化和监管评估的重要组成部分。可靠的评估需要互补的方法，以区分脂质组分的组织暴露与mRNA定位、分子完整性、细胞内递送、蛋白质表达和清除。监管评估同样必须考虑mRNA的瞬时性、其脂质载体和代谢物可能不同的持久性、以及给药途径和制剂组成对组织暴露的影响。本综述审视了mRNA和LNP处置的分子和生理决定因素，评估了当前分析方法测量的内容及其无法确定的信息，并综合了与开发可预测、组织选择性和可临床转化的mRNA疗法相关的临床前和临床证据。
2 从给药到功能性递送：调控mRNA-LNP处置的机制
mRNA-LNPs的生物分布和药代动力学由一系列相互关联的生物学过程共同决定，这些过程共同决定了组织暴露、细胞内递送、蛋白质表达和清除。虽然不同制剂存在差异，但五个核心通路现被广泛认为是mRNA-LNP处置的主要决定因素：(i) 途径依赖的转运和初始组织分布，(ii) 与生物流体的理化相互作用导致蛋白冠形成，(iii) 受体介导的细胞摄取和器官趋向性，(iv) 内体逃逸和细胞内运输，以及(v) 代谢降解和免疫介导的清除。这些通路顺序作用而非独立进行，任何阶段的改变都会影响下游药代动力学、组织特异性、疗效和安全性。重要的是，LNP相关脂质、完整mRNA和编码蛋白的定位代表了不同但相关的结果，具有不同的动力学特征。放射性标记、分子定量、成像和基于蛋白质的研究之间出现的明显差异，可能反映了所测量生物学终点的不同，而非矛盾的结果。
2.1 途径依赖的组织进入
给药后，LNPs应迅速通过淋巴管和血管网络分布，其扩散程度主要由给药途径、局部组织结构以及纳米颗粒理化性质决定。肌内（IM）和皮下（SC）给药有利于初始停留在注射部位，随后引流至区域淋巴结，而静脉（IV）给药则绕过局部淋巴管，导致立即全身暴露并以肝脏蓄积为主。粒径、表面电荷、聚乙二醇（PEG）-脂质含量和局部血管通透性进一步影响转运动力学和组织可及性。研究表明，IM给药后，mRNA主要集中在注射部位和引流淋巴结，随后短暂播散至脾脏和肝脏，峰值组织浓度出现在2-8小时内。SC给药产生相似的分布，但动力学更慢且停留时间更长，说明给药途径不仅改变生物分布的程度，也影响组织暴露和药代动力学行为。呼吸道给药可将mRNA-LNPs直接递送至气道上皮，从而绕过体循环和肝脏的首过清除。然而，鼻内给药并非简单易行，动物研究表明制剂可能具有反应原性。吸入给药时，雾化或滴注的纳米颗粒根据空气动力学直径沉积在整个呼吸道，较大颗粒主要滞留在上气道，较小颗粒可到达细支气管和肺泡区。沉积后，LNPs必须先穿过黏液层和肺表面活性物质，才能与上皮细胞、肺泡巨噬细胞和驻留抗原呈递细胞相互作用。尽管IV给药仍是全身mRNA-LNP递送的主要途径，但近期研究表明腹腔（IP）给药可显著改变组织生物分布并实现胰腺选择性递送。鞘内（IT）给药已成为一种有前景的策略，通过绕过血脑屏障（BBB）实现高效的中枢神经系统（CNS）mRNA递送。视网膜下注射是眼部mRNA-LNP疗法的重要给药途径，尤其适用于影响视网膜色素上皮（RPE）和感光细胞的疾病。
2.2 注射侧别和回忆应答
影响mRNA-LNP生物分布和免疫应答的另一个因素是注射侧别，即连续疫苗剂量是在同侧肢体还是对侧肢体给药。新兴证据表明，侧别通过决定加强接种时重新激活哪些引流淋巴结来影响淋巴引流和回忆免疫。同侧加强优先重新激活现有生发中心，促进更快的亲和力成熟、滤泡辅助性T细胞扩增和早期抗体产生，而对侧加强则招募解剖上不同的淋巴结，可能拓宽生发中心应答的空间分布。
2.3 从生物特性到功能性递送：蛋白冠、摄取和细胞内命运
进入生物流体和组织后，mRNA-LNPs经历一系列细胞外和细胞内相互作用，决定组织暴露是否导致功能性蛋白质表达。蛋白冠的形成影响受体参与和细胞趋向性，但细胞摄取之后必须伴随高效的内体逃逸和完整mRNA的胞质释放。后续翻译和编码蛋白的持久性决定了生物学反应的幅度和持续时间，强调组织积累、细胞摄取和功能性递送是相关但不等价的结果。
2.3.1 作为器官趋向性决定因素的蛋白冠生物界面
一旦进入生物体液，mRNA-LNPs迅速吸附血浆蛋白形成蛋白冠，该蛋白冠取代合成纳米颗粒表面成为细胞识别的生物界面，现被认为是生物分布、细胞摄取和清除的主要决定因素，而非被动涂层。虽然载脂蛋白E（ApoE）仍是最具特征的蛋白冠成分，通过低密度脂蛋白受体（LDLR）家族成员促进受体介导的摄取并解释了许多LNP制剂的固有肝脏趋向性，但定量蛋白质组学研究已证明蛋白冠是一个动态混合物，包括高密度脂蛋白（HDL）、白蛋白、玻连蛋白、补体蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原、C反应蛋白和α2-巨球蛋白，其组成取决于脂质化学性质、给药途径和宿主生理状态。
2.3.2 内体逃逸作为摄取和翻译之间的瓶颈
组织定位后，LNPs主要通过涉及LDL受体、清道夫受体、补体受体和Fcγ受体的受体介导内吞作用被内化。然而，成功的细胞摄取本身并不能确保有效递送。当前证据一致认为内体逃逸是限制mRNA疗法的主要细胞内瓶颈，只有一小部分内化的纳米颗粒能在溶酶体降解前将完整mRNA释放到胞质中。可电离脂质通过在酸性内体环境中质子化、破坏内体膜并促进胞质释放来促进逃逸。
2.3.3 翻译、蛋白质持久性和清除动力学
一旦释放到胞质中，完整mRNA经历核糖体翻译，随后被内源性核糖核酸酶降解。重要的是，翻译后的蛋白质通常比mRNA模板持续更长时间，造成分子生物分布和生物活性之间的时间脱节。mRNA-LNP药代动力学的最后阶段由脂质和核酸组分的降解和清除所支配。可电离脂质主要在肝脏和脾脏内代谢，胆固醇进入内源性脂质途径，PEG-脂质逐渐解离后进行肝胆排泄。新型含酯键或缩酮键的可生物降解可电离脂质可加速水解，减少长期组织滞留，同时维持高效递送。
3 从动物模型到人类：当前生物分布证据的支持
临床前和临床证据共同构成了我们对mRNA-LNP制剂给药后行为的当前理解基础。在小鼠、大鼠和非人灵长类动物中的早期研究确立了这些纳米颗粒很少局限于注射部位。在啮齿动物中，脂质和mRNA的可测量浓度存在于肝脏、脾脏和引流淋巴结中，少量出现在肾脏、肺部和偶见于心脏。在非人灵长类动物中也观察到类似模式，但暴露的幅度和动力学因淋巴引流、代谢率和肝脏清除的物种差异而异。肝脏始终是LNP沉积和降解的主要部位，这种趋向性反映了载脂蛋白和LDLR的丰富性，它们通过与蛋白冠的相互作用介导纳米颗粒的肝脏摄取。脾脏也显示出高积累，由其密集的巨噬细胞和树突状细胞网络驱动。淋巴结是主要的免疫枢纽，抗原表达在此触发适应性反应，尤其是在IM或SC给药后。最近的临床前研究阐明了制剂化学如何决定这一模式。可电离脂质的结构影响细胞进入和清除，而PEG-脂质的摩尔比控制循环时间和颗粒稳定性。调节脂质极性或引入两性离子组分可将生物分布重定向至脾脏或肺部，形成了现在实现肝外递送的SORT策略的基础。人体数据虽不那么全面，但正在通过临床试验、药代动力学建模和mRNA疫苗上市后分析不断扩展。新兴数据表明，完整LNPs在正常生理条件下不易穿过BBB。除了BBB，胎盘也是一个重要的生理屏障。降解和清除的动力学现已得到更好表征。在大多数模型中，mRNA在完成酶促分解前持续不到48小时，而脂质组分通过肝胆途径代谢更慢。跨物种比较强调了现有动物模型的稳健性和局限性。总体而言，现有证据描绘了mRNA-LNP生物分布是瞬时的、依赖制剂的，并且主要局限于淋巴和网状内皮器官。
4 表征mRNA-LNPs的体内命运：方法和解释局限性
表征mRNA-LNPs的体内命运需要互补的分析方法，这些方法针对递送过程的不同组分和阶段。如表2所示，这些方法在灵敏度、特异性、定量能力以及空间和时间分辨率方面存在显著差异。LNP相关脂质或标记物的测量可提供载体分布和清除信息，但不一定证明完整纳米颗粒的存在。核酸检测可定位和量化可靶向的RNA序列，但检测本身并不确立mRNA保持全长且具备翻译能力。反之，报告基因和基于蛋白质的方法可证明功能性表达，但不能独立确定弱表达或无表达是由于有限的组织暴露、无效的细胞摄取、RNA降解还是不充分的内体逃逸所致。细胞分辨成像、空间和单细胞技术、条形码筛选以及内体逃逸测定提供了额外的机制分辨率，而基于生理的药代动力学（PBPK）和定量系统药理学（QSP）模型将这些互补数据集整合到跨组织、时间点和物种的框架中。因此，稳健的解释需要多模态策略，将载体暴露、mRNA定位和完整性、细胞内递送以及功能性蛋白质表达视为相关但不等价的结果。
4.1 LNP分布和脂质清除
4.1.1 放射性标记和放射自显影 为了解答LNP相关脂质在哪里积累以及如何清除的问题，放射性标记仍然是定量生物分布研究的参考标准，因为它能够独立于转基因表达直接测量组织中纳米颗粒相关组分。将3H或14C等放射性同位素掺入脂质组分，或将35S掺入RNA骨架，可实现定量全身放射自显影、闪烁计数和组织放射性测量，从而在不依赖成功细胞摄取或蛋白质翻译的情况下，提供随时间变化的所有器官的绝对药代动力学数据。因此，放射性标记已被广泛采用于mRNA-LNPs的监管生物分布评估，并仍是衡量新兴分析方法的标准。放射性标记的主要优势在于其量化总组织暴露的能力，从而实现对吸收、分布、代谢和清除（ADME）的稳健评估。与荧光或生物发光成像不同，放射性标记无论标记分子的生物活性如何均可检测，使其特别适用于定义清除动力学和识别参与脂质代谢的器官。尽管有这些优势，放射性标记也存在重要局限性。大多数放射性标记研究单独追踪脂质载体或核酸货物，而非同时监测脂质分布、完整mRNA、降解的RNA片段和翻译后的蛋白质。因此，放射性标记无法区分组织中检测到的放射性代表完整的纳米颗粒、释放的脂质代谢物、降解的mRNA还是残留的标记片段。
4.1.2 光学和生物发光成像 光学成像技术，包括荧光和生物发光成像，已成为研究mRNA-LNPs时空行为不可或缺的工具，因为它们能够对同一动物在多个时间点进行无创纵向监测，从而减少个体间变异并提供无法从终点组织分析获得的动态信息。与量化总组织相关放射性的放射性标记不同，光学成像可根据所使用的报告系统区分纳米颗粒定位和功能性转基因表达。因此，这些方法在早期制剂筛选和给药途径比较评估中尤为有价值，此时制剂间的相对差异往往比绝对组织浓度更具信息性。
